作者shenhsu (軒)
看板Biotech
標題[求救] 最近的ligation很難搞...有人有好建議嗎?
時間Thu Apr 28 12:27:42 2011
最近在接3個construct
不是大片段就是blunt end
接了快3個月了還是接不出來>< (快被老闆逼瘋了...)
又不能換接的方式 (因為前人是這樣接要比較...)
實驗室用的是NEB的T4 ligase 16度C overnight
爬文有看到用4度C處理的會比較好嗎？
不知道版上的先進們有沒有什麼好建議..orz
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(1)
1700 bp insert 接
12k vector
insert已先clone好於TA vector上
cutting site設計BamHI+HindIII切下
感覺應該沒什麼困難...但就是接不起來....
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(2)
5.4k vector 接
8.4k vector
將2個vector用KpnI一刀切開後互黏成將近14k的plasmid
2個vector抗不同抗生素 因此2種抗生素同時篩選能長的應該就是接成的
但都不長.....
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(3)
insert 950 bp 要deletion序列中間片段 7 bp
所以設計primer夾出該片段以外2側的片段(150 & 800 bp)
2片段外端在primer上各別設計BamHI和EcoRI cutting site
(因為PCR後要digestion因此有多設計2bp, NEB說BamHI/EcoRI只要1bp就能切..)
digestion之後2片段與 4.7k vector做 ligation
(有處理PNK讓PCR片段+磷酸根)
想接成vector/EcoRI-----╡(blunt end, deletion的片段)╞-----BamHI/vector
我本來是想中間再設計一個cutting site分2次接
但老闆堅持這樣一定接的起來
而且說這是promoter怕多出cutting site序列影響transcrip
但怎麼樣就是接不出來啊~~~~~~
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以上
我想如果要仔細找問題的話會有很多地方要討論會很複雜~"~
所以想先請問看看這樣的一些construct
有沒有一些撇步或特別的方法or該注意的地方呢??
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.48.144
1F：推 Kunzite:Ligation的水是否乾淨？ 04/28 14:05
2F：推 musicman:你的insert都好長啊......其實光看這樣的內容 不太能幫你 04/28 14:18
3F：→ musicman:建議什麼,少了很多資訊,許多實驗條件都沒講(不方便透漏則 04/28 14:19
4F：→ musicman:另當別論) 希望可以多一點有用的資訊 好讓大家集思廣益 04/28 14:19
5F：→ shenhsu:我們這的水是先RO在二次去離子水...然後滅菌後使用... 04/28 14:34
6F：→ shenhsu:是沒有不方便透露啦^^"只是我怕每個都打太詳細會太複雜 04/28 14:35
7F：→ shenhsu:想說主要的方向先打出來...不知道該多提供些什麼資訊好?? 04/28 14:36
8F：推 musicman:如 insert : vector 的比例,反應溫度時間 等等.. 04/28 14:40
9F：→ shenhsu:反應都是20ul 16度C overnight第一組有試過3:1 5:1都失敗 04/28 14:42
10F：→ shenhsu:第二三組的話...一個因為2段都是vector 一個有三段... 04/28 14:43
11F：→ shenhsu:所以都是取差不多等量(1:1 3:3:1)下去做~"~ 04/28 14:44
12F：推 musicman:blunt end ligation 本身就比較困難 試試看 5:5:1 記得要 04/28 14:56
13F：→ musicman:做 control組 04/28 14:56
14F：→ musicman:第二組 可能兩個vector自接的狀況會很嚴重,至少挑一個 04/28 14:58
15F：→ musicman:vector做一下CIP或SAP, 比例不要用1:1 04/28 15:00
16F：→ musicman:第一組的 insert真的頗大,7k....有辦法拆成兩段嗎? 04/28 15:02
17F：→ shenhsu:1.7k啦 XD 1700 bp 04/28 15:02
18F：→ musicman:抱歉,看錯~1.7K應該還好... 04/28 15:07
19F：→ shenhsu:請問上面說的control組是指..plasmid? 還是其他的control? 04/28 16:51
20F：推 chung1987:試試quick ligase，室溫5分鐘搞定 04/28 16:57
21F：推 Realthugz:趕時間我試過丟進37度一小時 直接transform 這是邪道 04/28 20:22
22F：→ Realthugz:不過7K insert真是贏了 04/28 20:23
23F：→ shenhsu:恩..應該說我主要想問的是接大片段&blunt end的秘訣XDDD 04/28 22:07
24F：推 Realthugz:blunt end就 Vector CIP一下看看囉 04/28 22:26
25F：推 yaliu:1跟2有試過轉型這麼大size的效率如何嗎？另外2應該複製ori 04/29 02:13
26F：→ yaliu:不同吧？3的話應該是用pfu PCR吧～然後想問一下若用pfu PCR 04/29 02:14
27F：→ yaliu:還需要磷酸化嗎？？我以為他P完會有磷耶... 04/29 02:15
28F：→ yaliu:你做的size都很大喔～～祝你好運～～ 04/29 02:16
有試過轉空的12k vector ok
然後需要PNK是爬文說PCR完沒有磷 0.0
29F：推 ararthur:我在想第二組是不是讓他recovery時間延長一些 畢竟要製造 04/29 02:19
30F：→ ararthur:兩種抗生素 bac.也要有足夠體力 04/29 02:20
31F：→ ararthur:第一組 接不起來是說跑膠沒有band嗎?? 有時候就直接丟下 04/29 02:23
32F：→ ararthur:去transform 也可以吧 04/29 02:23
目前是SOC recover 1 hr
接不起來是要嘛不長 要嘛就只有空vector
ligation後跑膠嗎?! 這我沒試過耶...
因為以前學長是說跑膠也只能看到insert vector的band
接成功的plasmid量太少看不到...
33F：推 icome:第二個好酷 可是一個plasmid有兩個ori不會怎樣嗎 04/29 09:34
34F：→ yaliu:ori不同就可以，所以有那種穿梭質體阿 04/29 14:09
※ 編輯: shenhsu 來自: 140.115.48.144 (04/29 15:21)
35F：推 yaliu:還是你要不要試試ligation產物進行PCR~就拿vector primer 04/29 21:46
36F：→ yaliu:PCR insert~這樣至少確保ligation沒問題 04/29 21:47
37F：→ yaliu:跑膠也是可以啦～應該可以看到不同構型～但也要DNA夠濃 04/29 21:49
38F：→ yaliu:才看的到不同的構型 04/29 21:49
39F：推 dodomilk:拿vector primer PCR insert <= 請問是什麼意思？ 04/29 21:51
40F：推 yaliu:就是insert如果有成功跟vector連在一起，我們可以用靠近 04/29 21:58
41F：→ yaliu:insert處的vector序列，設計primer往內PCR~就可以P出inser了 04/29 21:59
42F：→ yaliu:例如pUC19的M13F/R 或者pGEM-T的T7/SP6 04/29 21:59
43F：→ yaliu:對了，定序質體的insert通常都用這些vector定 04/29 22:00
44F：→ Realthugz:就是從promoter F跟insert R去夾 就定序的方式囉 04/29 22:03
45F：推 dodomilk:嗯...不過如果有做CIP的話就P不出來吧 04/29 22:41
46F：推 yaliu:還是可以阿～是PCR ligation產物～iverse PCR有類似的原理 04/29 23:17
47F：→ yaliu:拼錯～是inverse PCR 04/29 23:21
48F：推 dodomilk:CIP之後得到的ligation產物是nicked DNA 04/29 23:39
49F：→ dodomilk:PCR第一步denature的時候，產物會變成linear form 04/29 23:40
50F：→ dodomilk:斷在想要P出來的片段中，應該P不出來吧？ 04/29 23:41
51F：推 yaliu:我的意思是～ligation如果有成功會接成circular，通常CIP只 05/01 13:51
52F：→ yaliu:作vector，insert不做。所以insert可以跟vector接起來 05/01 13:52
53F：→ yaliu:這樣用vector的primer 往insert PCR，不就可以P出含有insert 05/01 13:52
54F：→ yaliu:的部份～ 05/01 13:53
55F：→ rolajohan:用羅氏的ligase試試看 05/13 19:54