作者shenhsu (轩)
看板Biotech
标题[求救] 最近的ligation很难搞...有人有好建议吗?
时间Thu Apr 28 12:27:42 2011
最近在接3个construct
不是大片段就是blunt end
接了快3个月了还是接不出来>< (快被老板逼疯了...)
又不能换接的方式 (因为前人是这样接要比较...)
实验室用的是NEB的T4 ligase 16度C overnight
爬文有看到用4度C处理的会比较好吗？
不知道版上的先进们有没有什麽好建议..orz
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(1)
1700 bp insert 接
12k vector
insert已先clone好於TA vector上
cutting site设计BamHI+HindIII切下
感觉应该没什麽困难...但就是接不起来....
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(2)
5.4k vector 接
8.4k vector
将2个vector用KpnI一刀切开後互黏成将近14k的plasmid
2个vector抗不同抗生素 因此2种抗生素同时筛选能长的应该就是接成的
但都不长.....
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(3)
insert 950 bp 要deletion序列中间片段 7 bp
所以设计primer夹出该片段以外2侧的片段(150 & 800 bp)
2片段外端在primer上各别设计BamHI和EcoRI cutting site
(因为PCR後要digestion因此有多设计2bp, NEB说BamHI/EcoRI只要1bp就能切..)
digestion之後2片段与 4.7k vector做 ligation
(有处理PNK让PCR片段+磷酸根)
想接成vector/EcoRI-----╡(blunt end, deletion的片段)╞-----BamHI/vector
我本来是想中间再设计一个cutting site分2次接
但老板坚持这样一定接的起来
而且说这是promoter怕多出cutting site序列影响transcrip
但怎麽样就是接不出来啊~~~~~~
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以上
我想如果要仔细找问题的话会有很多地方要讨论会很复杂~"~
所以想先请问看看这样的一些construct
有没有一些撇步或特别的方法or该注意的地方呢??
谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.48.144
1F：推 Kunzite:Ligation的水是否乾净？ 04/28 14:05
2F：推 musicman:你的insert都好长啊......其实光看这样的内容 不太能帮你 04/28 14:18
3F：→ musicman:建议什麽,少了很多资讯,许多实验条件都没讲(不方便透漏则 04/28 14:19
4F：→ musicman:另当别论) 希望可以多一点有用的资讯 好让大家集思广益 04/28 14:19
5F：→ shenhsu:我们这的水是先RO在二次去离子水...然後灭菌後使用... 04/28 14:34
6F：→ shenhsu:是没有不方便透露啦^^"只是我怕每个都打太详细会太复杂 04/28 14:35
7F：→ shenhsu:想说主要的方向先打出来...不知道该多提供些什麽资讯好?? 04/28 14:36
8F：推 musicman:如 insert : vector 的比例,反应温度时间 等等.. 04/28 14:40
9F：→ shenhsu:反应都是20ul 16度C overnight第一组有试过3:1 5:1都失败 04/28 14:42
10F：→ shenhsu:第二三组的话...一个因为2段都是vector 一个有三段... 04/28 14:43
11F：→ shenhsu:所以都是取差不多等量(1:1 3:3:1)下去做~"~ 04/28 14:44
12F：推 musicman:blunt end ligation 本身就比较困难 试试看 5:5:1 记得要 04/28 14:56
13F：→ musicman:做 control组 04/28 14:56
14F：→ musicman:第二组 可能两个vector自接的状况会很严重,至少挑一个 04/28 14:58
15F：→ musicman:vector做一下CIP或SAP, 比例不要用1:1 04/28 15:00
16F：→ musicman:第一组的 insert真的颇大,7k....有办法拆成两段吗? 04/28 15:02
17F：→ shenhsu:1.7k啦 XD 1700 bp 04/28 15:02
18F：→ musicman:抱歉,看错~1.7K应该还好... 04/28 15:07
19F：→ shenhsu:请问上面说的control组是指..plasmid? 还是其他的control? 04/28 16:51
20F：推 chung1987:试试quick ligase，室温5分钟搞定 04/28 16:57
21F：推 Realthugz:赶时间我试过丢进37度一小时 直接transform 这是邪道 04/28 20:22
22F：→ Realthugz:不过7K insert真是赢了 04/28 20:23
23F：→ shenhsu:恩..应该说我主要想问的是接大片段&blunt end的秘诀XDDD 04/28 22:07
24F：推 Realthugz:blunt end就 Vector CIP一下看看罗 04/28 22:26
25F：推 yaliu:1跟2有试过转型这麽大size的效率如何吗？另外2应该复制ori 04/29 02:13
26F：→ yaliu:不同吧？3的话应该是用pfu PCR吧～然後想问一下若用pfu PCR 04/29 02:14
27F：→ yaliu:还需要磷酸化吗？？我以为他P完会有磷耶... 04/29 02:15
28F：→ yaliu:你做的size都很大喔～～祝你好运～～ 04/29 02:16
有试过转空的12k vector ok
然後需要PNK是爬文说PCR完没有磷 0.0
29F：推 ararthur:我在想第二组是不是让他recovery时间延长一些 毕竟要制造 04/29 02:19
30F：→ ararthur:两种抗生素 bac.也要有足够体力 04/29 02:20
31F：→ ararthur:第一组 接不起来是说跑胶没有band吗?? 有时候就直接丢下 04/29 02:23
32F：→ ararthur:去transform 也可以吧 04/29 02:23
目前是SOC recover 1 hr
接不起来是要嘛不长 要嘛就只有空vector
ligation後跑胶吗?! 这我没试过耶...
因为以前学长是说跑胶也只能看到insert vector的band
接成功的plasmid量太少看不到...
33F：推 icome:第二个好酷 可是一个plasmid有两个ori不会怎样吗 04/29 09:34
34F：→ yaliu:ori不同就可以，所以有那种穿梭质体阿 04/29 14:09
※ 编辑: shenhsu 来自: 140.115.48.144 (04/29 15:21)
35F：推 yaliu:还是你要不要试试ligation产物进行PCR~就拿vector primer 04/29 21:46
36F：→ yaliu:PCR insert~这样至少确保ligation没问题 04/29 21:47
37F：→ yaliu:跑胶也是可以啦～应该可以看到不同构型～但也要DNA够浓 04/29 21:49
38F：→ yaliu:才看的到不同的构型 04/29 21:49
39F：推 dodomilk:拿vector primer PCR insert <= 请问是什麽意思？ 04/29 21:51
40F：推 yaliu:就是insert如果有成功跟vector连在一起，我们可以用靠近 04/29 21:58
41F：→ yaliu:insert处的vector序列，设计primer往内PCR~就可以P出inser了 04/29 21:59
42F：→ yaliu:例如pUC19的M13F/R 或者pGEM-T的T7/SP6 04/29 21:59
43F：→ yaliu:对了，定序质体的insert通常都用这些vector定 04/29 22:00
44F：→ Realthugz:就是从promoter F跟insert R去夹 就定序的方式罗 04/29 22:03
45F：推 dodomilk:嗯...不过如果有做CIP的话就P不出来吧 04/29 22:41
46F：推 yaliu:还是可以阿～是PCR ligation产物～iverse PCR有类似的原理 04/29 23:17
47F：→ yaliu:拼错～是inverse PCR 04/29 23:21
48F：推 dodomilk:CIP之後得到的ligation产物是nicked DNA 04/29 23:39
49F：→ dodomilk:PCR第一步denature的时候，产物会变成linear form 04/29 23:40
50F：→ dodomilk:断在想要P出来的片段中，应该P不出来吧？ 04/29 23:41
51F：推 yaliu:我的意思是～ligation如果有成功会接成circular，通常CIP只 05/01 13:51
52F：→ yaliu:作vector，insert不做。所以insert可以跟vector接起来 05/01 13:52
53F：→ yaliu:这样用vector的primer 往insert PCR，不就可以P出含有insert 05/01 13:52
54F：→ yaliu:的部份～ 05/01 13:53
55F：→ rolajohan:用罗氏的ligase试试看 05/13 19:54