作者micocat (de novo)
看板Biotech
標題Re: [求救] Ligation 一直無法成功
時間Thu Apr 28 11:36:48 2011
: Transformation：取2 uL的ligation mixture加入50 uL的competent cells，冰上30 min
: ，42度C 40秒，冰上2 min，加入SOC medium 1 hr，取適量塗在含有ampicillin的LB
: agar plate上，positive control為未進行digestion的plasmids，negative control
: 為digestion後的plasmid，結果positive control長出來的菌落超過50個，但是negative
: control和ligation sample都沒有長出任何菌落。
: 以上條件已經重複約10次，做了快三個月了，均無法長出任何colony，請教大家這步驟是否有我未注意到
: 的地方呢？拜託大家了。
我想請問你的 " positive control為未進行digestion的plasmids "
是加了多少DNA 下去 transform 啊
competent cell 是自己做的嗎
可以測一下 transformation efficiency
如果連 uncut 的plasmid 都只長不到100顆的話...
ligation product 長不出來也是相當合理的...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.96.93
1F：推 FENOR:也不能這樣講，如果一開始用的vector量少還有抗生素濃度高 04/28 11:38
2F：→ FENOR:空vector長的少也還算合理。 04/28 11:38
3F：→ FENOR:不過我很贊成原PO的說法，也應該檢查細胞的狀況 04/28 11:39
4F：推 musicman:其實應該換一隻手 做看看XDDD 04/28 12:01
5F：→ yaliu:咦～跟我想的一樣～抗生素濃度我想應該也是通用濃度吧 04/29 01:59
6F：→ yaliu:所以真的要確認效率～～空vector整個很容易TNTC 04/29 02:00
7F：推 ararthur:請問TNTC是什麼?? 04/29 02:13
8F：→ ararthur:我贊成這裡的理論 PC 通常丟2ul進去 有recovery的話 colo 04/29 02:14
9F：→ ararthur:-ny數都會爆表才對 我只有做放很久的competent才會PC很少 04/29 02:15
10F：推 yaliu:too number to count (沒拼錯吧？) 04/29 02:19
11F：→ ararthur:嗯 那所以跟我想得是一樣囉 cell真的要check一下 如果放 04/29 02:20
12F：→ ararthur:circular form的DNA當PC 應該是整片連在一起的... 04/29 02:21
13F：推 akongapple:不好意思，這邊補充一下，目測的話應該有>100顆，只是 04/29 11:14
14F：→ akongapple:我講得比較保守，所以打>50顆，因為我也沒實際去數 04/29 11:14
15F：→ akongapple:另外competent cells是commercial的 04/29 11:15
16F：推 yaliu:只大於100其實也沒很好說實在的...一片取100ul塗嗎？沒稀釋? 04/29 14:08
17F：推 dodomilk:你能算出每microgram長出多少個colony嗎？ 04/29 15:26
18F：→ dodomilk:<10^6個的話就不太適合用來做clone 04/29 15:26
19F：推 akongapple:所以說positive control沒長很多的話代表ligation會長 04/29 17:57
20F：→ akongapple:不出來嗎？我大概都取20ng左右的plasmid去transform 04/29 17:58
21F：→ akongapple:competent cells用50 uL，加SOC medium恢復1 hr後 04/29 17:59
22F：→ akongapple:取300 uL塗盤，不過我在想positive control的數量只是 04/29 18:00
23F：→ akongapple:參考，ligation如果有成功就一定會長出來吧！還是我的 04/29 18:00
24F：→ akongapple:認知錯誤了？ 04/29 18:00
25F：→ micocat:同樣的competent cell lab其他人使用上ok嗎 04/29 18:35
26F：→ micocat:建議測一下competent cell的效率 04/29 18:36
27F：→ micocat:或是跟別家要一隻來試試 04/29 18:36
28F：→ micocat:transform完整plasmid應該要爆盤才對XD 04/29 18:38
29F：推 dodomilk:如果你的20ng是完整plasmid的話 效率只有5000 cfu/ug 04/29 19:05
30F：→ dodomilk:可以說是奇差無比。你說是買來的，應該是transformation 04/29 19:06
31F：→ dodomilk:步驟有致命性的錯誤 04/29 19:07
32F：→ dodomilk:1ng完整plasmid要能長出1000顆菌以上比較正常 04/29 19:08
33F：推 dodomilk:建議拿1ng轉進去，recovery後拿1/10菌液出來塗盤 04/29 19:12
34F：→ dodomilk:如果能長出100顆colony以上，再用來做clone會比較好 04/29 19:13
35F：推 akongapple:所以說因為有成功ligation的plasmid amount很少很少， 04/29 19:48
36F：→ akongapple:所以如果連positive control都長很少，更何況量少到在 04/29 19:49
37F：→ akongapple:膠上都看不出來的正確ligation產物，請問樓上是這個意 04/29 19:49
38F：→ akongapple:思嗎？如果有誤解請更正我，謝謝。 04/29 19:50
39F：→ akongapple:另外我在想，因為我在transformation的時候，為了省 04/29 19:50
40F：→ akongapple:competent cells，都會先等它完全溶解後，再從原本的 04/29 19:51
41F：→ akongapple:一管100uL分裝50uL到另一管，再進行transformation， 04/29 19:51
42F：→ akongapple:會不會是因此而降低了efficiency？ 04/29 19:52
43F：→ akongapple:可是我還是認為如果有正確ligation的話，就算量再少， 04/29 19:52
44F：→ akongapple:也足以讓E. coli長出來吧！ 04/29 19:52
45F：推 dodomilk:沒錯就是這樣。 另外ligation比其它還需要運氣沒有錯 04/29 21:32
46F：→ dodomilk:vector, insert, ATP, ligase需要同時撞在一起 04/29 21:34
47F：→ dodomilk:insert濃度還是vector的好幾倍，insert也會自接 04/29 21:35
48F：→ dodomilk:insert一自接就沒辦法和vector連在一起了 04/29 21:36
49F：→ dodomilk:即使你一開始vector+insert>200ng 有成功的也不到1ng 04/29 21:37
50F：推 yaliu:嗯嗯～～接成功的機率都少了，更別說還要進去菌體 04/29 21:41
51F：→ yaliu:而且我總覺得接成功的比原本就是環形的容易再掉(我的感覺啦) 04/29 21:43