作者micocat (de novo)
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标题Re: [求救] Ligation 一直无法成功
时间Thu Apr 28 11:36:48 2011
: Transformation：取2 uL的ligation mixture加入50 uL的competent cells，冰上30 min
: ，42度C 40秒，冰上2 min，加入SOC medium 1 hr，取适量涂在含有ampicillin的LB
: agar plate上，positive control为未进行digestion的plasmids，negative control
: 为digestion後的plasmid，结果positive control长出来的菌落超过50个，但是negative
: control和ligation sample都没有长出任何菌落。
: 以上条件已经重复约10次，做了快三个月了，均无法长出任何colony，请教大家这步骤是否有我未注意到
: 的地方呢？拜托大家了。
我想请问你的 " positive control为未进行digestion的plasmids "
是加了多少DNA 下去 transform 啊
competent cell 是自己做的吗
可以测一下 transformation efficiency
如果连 uncut 的plasmid 都只长不到100颗的话...
ligation product 长不出来也是相当合理的...
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.96.93
1F：推 FENOR:也不能这样讲，如果一开始用的vector量少还有抗生素浓度高 04/28 11:38
2F：→ FENOR:空vector长的少也还算合理。 04/28 11:38
3F：→ FENOR:不过我很赞成原PO的说法，也应该检查细胞的状况 04/28 11:39
4F：推 musicman:其实应该换一只手 做看看XDDD 04/28 12:01
5F：→ yaliu:咦～跟我想的一样～抗生素浓度我想应该也是通用浓度吧 04/29 01:59
6F：→ yaliu:所以真的要确认效率～～空vector整个很容易TNTC 04/29 02:00
7F：推 ararthur:请问TNTC是什麽?? 04/29 02:13
8F：→ ararthur:我赞成这里的理论 PC 通常丢2ul进去 有recovery的话 colo 04/29 02:14
9F：→ ararthur:-ny数都会爆表才对 我只有做放很久的competent才会PC很少 04/29 02:15
10F：推 yaliu:too number to count (没拼错吧？) 04/29 02:19
11F：→ ararthur:嗯 那所以跟我想得是一样罗 cell真的要check一下 如果放 04/29 02:20
12F：→ ararthur:circular form的DNA当PC 应该是整片连在一起的... 04/29 02:21
13F：推 akongapple:不好意思，这边补充一下，目测的话应该有>100颗，只是 04/29 11:14
14F：→ akongapple:我讲得比较保守，所以打>50颗，因为我也没实际去数 04/29 11:14
15F：→ akongapple:另外competent cells是commercial的 04/29 11:15
16F：推 yaliu:只大於100其实也没很好说实在的...一片取100ul涂吗？没稀释? 04/29 14:08
17F：推 dodomilk:你能算出每microgram长出多少个colony吗？ 04/29 15:26
18F：→ dodomilk:<10^6个的话就不太适合用来做clone 04/29 15:26
19F：推 akongapple:所以说positive control没长很多的话代表ligation会长 04/29 17:57
20F：→ akongapple:不出来吗？我大概都取20ng左右的plasmid去transform 04/29 17:58
21F：→ akongapple:competent cells用50 uL，加SOC medium恢复1 hr後 04/29 17:59
22F：→ akongapple:取300 uL涂盘，不过我在想positive control的数量只是 04/29 18:00
23F：→ akongapple:参考，ligation如果有成功就一定会长出来吧！还是我的 04/29 18:00
24F：→ akongapple:认知错误了？ 04/29 18:00
25F：→ micocat:同样的competent cell lab其他人使用上ok吗 04/29 18:35
26F：→ micocat:建议测一下competent cell的效率 04/29 18:36
27F：→ micocat:或是跟别家要一只来试试 04/29 18:36
28F：→ micocat:transform完整plasmid应该要爆盘才对XD 04/29 18:38
29F：推 dodomilk:如果你的20ng是完整plasmid的话 效率只有5000 cfu/ug 04/29 19:05
30F：→ dodomilk:可以说是奇差无比。你说是买来的，应该是transformation 04/29 19:06
31F：→ dodomilk:步骤有致命性的错误 04/29 19:07
32F：→ dodomilk:1ng完整plasmid要能长出1000颗菌以上比较正常 04/29 19:08
33F：推 dodomilk:建议拿1ng转进去，recovery後拿1/10菌液出来涂盘 04/29 19:12
34F：→ dodomilk:如果能长出100颗colony以上，再用来做clone会比较好 04/29 19:13
35F：推 akongapple:所以说因为有成功ligation的plasmid amount很少很少， 04/29 19:48
36F：→ akongapple:所以如果连positive control都长很少，更何况量少到在 04/29 19:49
37F：→ akongapple:胶上都看不出来的正确ligation产物，请问楼上是这个意 04/29 19:49
38F：→ akongapple:思吗？如果有误解请更正我，谢谢。 04/29 19:50
39F：→ akongapple:另外我在想，因为我在transformation的时候，为了省 04/29 19:50
40F：→ akongapple:competent cells，都会先等它完全溶解後，再从原本的 04/29 19:51
41F：→ akongapple:一管100uL分装50uL到另一管，再进行transformation， 04/29 19:51
42F：→ akongapple:会不会是因此而降低了efficiency？ 04/29 19:52
43F：→ akongapple:可是我还是认为如果有正确ligation的话，就算量再少， 04/29 19:52
44F：→ akongapple:也足以让E. coli长出来吧！ 04/29 19:52
45F：推 dodomilk:没错就是这样。 另外ligation比其它还需要运气没有错 04/29 21:32
46F：→ dodomilk:vector, insert, ATP, ligase需要同时撞在一起 04/29 21:34
47F：→ dodomilk:insert浓度还是vector的好几倍，insert也会自接 04/29 21:35
48F：→ dodomilk:insert一自接就没办法和vector连在一起了 04/29 21:36
49F：→ dodomilk:即使你一开始vector+insert>200ng 有成功的也不到1ng 04/29 21:37
50F：推 yaliu:嗯嗯～～接成功的机率都少了，更别说还要进去菌体 04/29 21:41
51F：→ yaliu:而且我总觉得接成功的比原本就是环形的容易再掉(我的感觉啦) 04/29 21:43