作者dodomilk (豆豆奶)
看板Biotech
標題Re: [求救] Ligation 一直無法成功
時間Thu Apr 28 02:50:09 2011
我ligation做了三個禮拜，參考過很多protocol都失敗，最後是自己亂做做出來的
作法如下：
vector: double digest → clean up → CIP → clean up ┐
├→ ligation
insert: double digest → clean up ──────────┘
特徵：不用做gel extraction
重點：1. restriction enzyme 一定要切乾淨，我是用五倍建議量反應兩倍時間
也就是10倍劑量。不用擔心會亂切，我做到現在還沒發生過這種事
(建議量：反應體積50ul、37度C下1小時，每unit可切1ug的DNA)
2. CIP也要做乾淨，我是用一倍建議量反應兩倍時間
3. vector在double digest和CIP之間的clean也許可以省略
當時會clean是怕restriction enzyme黏在那邊CIP無法作用
但後來聽實驗室其它人都是切完直接加CIP...
4. insert在PCR時template放越少越好，最好<100pg，以免干擾之後的transform
如果不放心的話，可以在PCR結束後加DpnI把template切掉
因為每次我gel extraction完，elute出來的DNA quality都很差，吸光區線一堆鋸齒很醜
我想可能是我做gel extraction的時候，哪個步驟出了問題
後來自己想到也許可以這樣做，莫名其妙就做出來了
ligation product可以拿一些(5~10 ul左右)出來跑膠看有沒有連接成功
如果看得到vector+insert的linear form的band，表示至少有一端連接成功
另一端也成功的機會很大
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 124.218.20.234
1F：→ Realthugz:反應時間長會不會亂切看enzyme吧 不是看運氣的 04/28 03:57
2F：→ Realthugz:然後... ligation不就把linear接起來嗎?? 04/28 03:58
3F：→ Realthugz:跟送進e.coli甚麼關係... 不然buffer裡dNTP幹嘛的? 04/28 03:59
4F：推 Realthugz:記錯 ATP 04/28 04:05
5F：推 akongapple:請問你的clean up步驟是指做甚麼樣的處理？ 04/28 08:01
6F：→ akongapple:另外，我記得有作CIP的話，一樣會形成環型，只是因為只 04/28 08:01
7F：→ akongapple:將insert的5' phosphate group接到vector的3' -OH，但 04/28 08:02
8F：→ akongapple:是vector上沒有5'phosphate group，所以會留有一個nick 04/28 08:03
9F：→ akongapple:送進E. coli後才會把這個nick補起來。 04/28 08:03
10F：→ dodomilk:嗯 那是我觀念錯誤，我修一下文 04/28 09:16
11F：→ dodomilk:反正這樣做得出來就對了 04/28 09:16
13F：→ dodomilk:一般的gel extraction/PCR clean up kit應該都可以 04/28 09:21
14F：→ dodomilk:一樓，我就是用號稱很容易亂切的EcoRI和BamHI 04/28 09:24
※ 編輯: dodomilk 來自: 140.109.40.39 (04/28 10:27)
15F：推 icome:其實RE跟CIP可以加在一起反應 不過我都是後加CIP不換buffer 04/28 10:51
16F：推 chung1987:同樓上，RE跟CIP一起加，較省時間 04/28 17:00
17F：推 ooufo:問一下~100ng的template會長幾顆? 05/10 14:44
18F：→ dodomilk:至少要10萬顆 05/11 11:30
19F：推 VincentYan: 很好奇你老闆看到如此揮霍的restriction enzyme劑量會 03/25 23:56
20F：推 VincentYan: 有何反應? 很貴欸 03/25 23:56