作者dodomilk (豆豆奶)
看板Biotech
标题Re: [求救] Ligation 一直无法成功
时间Thu Apr 28 02:50:09 2011
我ligation做了三个礼拜，参考过很多protocol都失败，最後是自己乱做做出来的
作法如下：
vector: double digest → clean up → CIP → clean up ┐
├→ ligation
insert: double digest → clean up ──────────┘
特徵：不用做gel extraction
重点：1. restriction enzyme 一定要切乾净，我是用五倍建议量反应两倍时间
也就是10倍剂量。不用担心会乱切，我做到现在还没发生过这种事
(建议量：反应体积50ul、37度C下1小时，每unit可切1ug的DNA)
2. CIP也要做乾净，我是用一倍建议量反应两倍时间
3. vector在double digest和CIP之间的clean也许可以省略
当时会clean是怕restriction enzyme黏在那边CIP无法作用
但後来听实验室其它人都是切完直接加CIP...
4. insert在PCR时template放越少越好，最好<100pg，以免干扰之後的transform
如果不放心的话，可以在PCR结束後加DpnI把template切掉
因为每次我gel extraction完，elute出来的DNA quality都很差，吸光区线一堆锯齿很丑
我想可能是我做gel extraction的时候，哪个步骤出了问题
後来自己想到也许可以这样做，莫名其妙就做出来了
ligation product可以拿一些(5~10 ul左右)出来跑胶看有没有连接成功
如果看得到vector+insert的linear form的band，表示至少有一端连接成功
另一端也成功的机会很大
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 124.218.20.234
1F：→ Realthugz:反应时间长会不会乱切看enzyme吧 不是看运气的 04/28 03:57
2F：→ Realthugz:然後... ligation不就把linear接起来吗?? 04/28 03:58
3F：→ Realthugz:跟送进e.coli甚麽关系... 不然buffer里dNTP干嘛的? 04/28 03:59
4F：推 Realthugz:记错 ATP 04/28 04:05
5F：推 akongapple:请问你的clean up步骤是指做甚麽样的处理？ 04/28 08:01
6F：→ akongapple:另外，我记得有作CIP的话，一样会形成环型，只是因为只 04/28 08:01
7F：→ akongapple:将insert的5' phosphate group接到vector的3' -OH，但 04/28 08:02
8F：→ akongapple:是vector上没有5'phosphate group，所以会留有一个nick 04/28 08:03
9F：→ akongapple:送进E. coli後才会把这个nick补起来。 04/28 08:03
10F：→ dodomilk:嗯 那是我观念错误，我修一下文 04/28 09:16
11F：→ dodomilk:反正这样做得出来就对了 04/28 09:16
13F：→ dodomilk:一般的gel extraction/PCR clean up kit应该都可以 04/28 09:21
14F：→ dodomilk:一楼，我就是用号称很容易乱切的EcoRI和BamHI 04/28 09:24
※ 编辑: dodomilk 来自: 140.109.40.39 (04/28 10:27)
15F：推 icome:其实RE跟CIP可以加在一起反应 不过我都是後加CIP不换buffer 04/28 10:51
16F：推 chung1987:同楼上，RE跟CIP一起加，较省时间 04/28 17:00
17F：推 ooufo:问一下~100ng的template会长几颗? 05/10 14:44
18F：→ dodomilk:至少要10万颗 05/11 11:30
19F：推 VincentYan: 很好奇你老板看到如此挥霍的restriction enzyme剂量会 03/25 23:56
20F：推 VincentYan: 有何反应? 很贵欸 03/25 23:56