※ 引述《akongapple (阿康)》之銘言： : 關於ligation的相關問題，版上有許多資訊，有先爬了一下版上的相關資料， : 可是我還是想不出我的問題出在哪裡，所以想PO上來請教一下大家，拜託大家了， : 以下是我的實驗步驟： : Insert DNA：以pEGFP-C1為template，用自行設計的primers進行PCR， : primers上有設計好的restriction enzyme cutting sites，在cutting sites以外各有 : 預留了6 bp以上的sequence，以避免restriction enzyme無法辨認進行cutting， : PCR出來的長度共814 bp，因為我想利用一段PCR sequence做出兩種insert DNA， : 所以PCR sequence包含有EGFP gene和兩個以上的restriction enzyme cutting sites， : 也就是類似MCS的sequence。 : 經由EcoRI和HindIII切完後為793 bp為第一個insert DNA，而經由KpnI和HindIII切完後 : 為771 bp為第二個insert DNA，確認方式為跑agarose gel，主要是用2.5% agarose gel : 進行確認，可以發現經由restriction enzyme反應後的band相較於PCR的band會位於較低 : 的位置，而切膠純化主要是用1.4% agarose gel，純化後的濃度大概在22 ng/uL左右， : 另外純化後的insert DNA若單獨進行ligation後跑膠可以發現有形成dimer的band， : 大約在1500 bp稍微上面一點的位置，因此應該可以證明insert DNA有確實地被 : restriction enzyme進行cutting。 : Vector DNA：主要是用實驗室現有的兩個plasmids，plasmids上面帶有ampicillin : resistent gene，而第一個plasmid可以被EcoRI和HindIII進行cutting，切完後的片段 : 為4512、725、509和47 bp，用 1.4% agarose gel跑膠後將4512 bp的band進行切膠 : 純化作為vector DNA；第二個plasmid可以被KpnI和HindIII進行cutting， : 切完後的片段為4606和1265bp，一樣用1.4% agarose gel跑膠後將4606 bp的band進行 : 切膠純化後作為vector DNA，兩者在進行切膠純化前均有用CIP作處理，純化後的濃度 : 均約在50 ng/uL左右，另外純化後的vector DNA有單獨進行ligation後跑膠，發現並無 : 其他的band，只有在6557到4361 bp的marker間有single band。 : Ligation reaction；先設定vector DNA為100 ng，依據molar ratio insert : vector = : 1:1或3:1加入insert DNA，T4 ligase和buffer各加入 1 uL，反應體積為10 uL， : Total DNA amount約在100~150 ng左右，反應條件為4度C over night。 : Transformation：取2 uL的ligation mixture加入50 uL的competent cells，冰上30 min : ，42度C 40秒，冰上2 min，加入SOC medium 1 hr，取適量塗在含有ampicillin的LB : agar plate上，positive control為未進行digestion的plasmids，negative control : 為digestion後的plasmid，結果positive control長出來的菌落超過50個，但是negative : control和ligation sample都沒有長出任何菌落。 : 以上條件已經重複約10次，做了快三個月了，均無法長出任何colony，請教大家這步驟是否有我未注意到 : 的地方呢？拜託大家了。 非常感謝大家的回應，在這邊做一下補充，實驗室現有兩個plasmids是之前學長所clone 出來的，而這兩個plasmids本身都是由pTTQ18 vector所modified出來的，我現在做的 動作就是把之前學長insert進去的DNA切下來然後把我的insert進去，因為之前學長在 作insert的時候前後都有預留cutting site以便之後可以把這段insert DNA切下來，所以 第一個plasmids可以用EcoRI和HindIII把之前學長insert進去的DNA切下來，共切四刀， 而不會切到vector本身帶有的ampicillin resistent gene，第二個plasmid也是一樣， 但只需切兩刀，關於plasmid的設計都有用vector NTI作確認過了。 而我現在的目的就是要把pEGFP-C1上的EGFP gene給PCR出來clone到實驗室現有的 vector上去做protein expression，因為pTTQ18 vector可以用E. coli 大量表現。 而positive control所用的DNA就是實驗室現有的plasmids，所以是一定會長出來。 關於ligation條件，之前也有試過反應總體積20 uL，22度C、16度C和4度C都試過了， 就是長不出來。 至於為什麼只取ligation mixture 2 uL是因為參考molecular cloning的protocol， 怕萬一取 10 uL 加入competent cells會影響到 transformation 的效率。 另外，CIP應該是要在切膠純化前加還是切膠純化後加呢？ 就我的認知假設vector在digestion反應完後進行切膠純化後加CIP，這樣一來CIP不就會 殘留在vector的溶液裡，這時如果直接拿去和insert DNA做ligation，這樣insert DNA 不就也會被去磷酸根了，所以我才會選擇vector在做完digestion後就直接加CIP反應， 反應完再切膠純化。 以上補充希望有讓大家更了解我的實驗，只是我還是不知道是哪裡出了問題 =.= 還是得用TA clone來純化出我要的insert DNA會比較準確呢？ --

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