※ 引述《akongapple (阿康)》之铭言： : 关於ligation的相关问题，版上有许多资讯，有先爬了一下版上的相关资料， : 可是我还是想不出我的问题出在哪里，所以想PO上来请教一下大家，拜托大家了， : 以下是我的实验步骤： : Insert DNA：以pEGFP-C1为template，用自行设计的primers进行PCR， : primers上有设计好的restriction enzyme cutting sites，在cutting sites以外各有 : 预留了6 bp以上的sequence，以避免restriction enzyme无法辨认进行cutting， : PCR出来的长度共814 bp，因为我想利用一段PCR sequence做出两种insert DNA， : 所以PCR sequence包含有EGFP gene和两个以上的restriction enzyme cutting sites， : 也就是类似MCS的sequence。 : 经由EcoRI和HindIII切完後为793 bp为第一个insert DNA，而经由KpnI和HindIII切完後 : 为771 bp为第二个insert DNA，确认方式为跑agarose gel，主要是用2.5% agarose gel : 进行确认，可以发现经由restriction enzyme反应後的band相较於PCR的band会位於较低 : 的位置，而切胶纯化主要是用1.4% agarose gel，纯化後的浓度大概在22 ng/uL左右， : 另外纯化後的insert DNA若单独进行ligation後跑胶可以发现有形成dimer的band， : 大约在1500 bp稍微上面一点的位置，因此应该可以证明insert DNA有确实地被 : restriction enzyme进行cutting。 : Vector DNA：主要是用实验室现有的两个plasmids，plasmids上面带有ampicillin : resistent gene，而第一个plasmid可以被EcoRI和HindIII进行cutting，切完後的片段 : 为4512、725、509和47 bp，用 1.4% agarose gel跑胶後将4512 bp的band进行切胶 : 纯化作为vector DNA；第二个plasmid可以被KpnI和HindIII进行cutting， : 切完後的片段为4606和1265bp，一样用1.4% agarose gel跑胶後将4606 bp的band进行 : 切胶纯化後作为vector DNA，两者在进行切胶纯化前均有用CIP作处理，纯化後的浓度 : 均约在50 ng/uL左右，另外纯化後的vector DNA有单独进行ligation後跑胶，发现并无 : 其他的band，只有在6557到4361 bp的marker间有single band。 : Ligation reaction；先设定vector DNA为100 ng，依据molar ratio insert : vector = : 1:1或3:1加入insert DNA，T4 ligase和buffer各加入 1 uL，反应体积为10 uL， : Total DNA amount约在100~150 ng左右，反应条件为4度C over night。 : Transformation：取2 uL的ligation mixture加入50 uL的competent cells，冰上30 min : ，42度C 40秒，冰上2 min，加入SOC medium 1 hr，取适量涂在含有ampicillin的LB : agar plate上，positive control为未进行digestion的plasmids，negative control : 为digestion後的plasmid，结果positive control长出来的菌落超过50个，但是negative : control和ligation sample都没有长出任何菌落。 : 以上条件已经重复约10次，做了快三个月了，均无法长出任何colony，请教大家这步骤是否有我未注意到 : 的地方呢？拜托大家了。 非常感谢大家的回应，在这边做一下补充，实验室现有两个plasmids是之前学长所clone 出来的，而这两个plasmids本身都是由pTTQ18 vector所modified出来的，我现在做的 动作就是把之前学长insert进去的DNA切下来然後把我的insert进去，因为之前学长在 作insert的时候前後都有预留cutting site以便之後可以把这段insert DNA切下来，所以 第一个plasmids可以用EcoRI和HindIII把之前学长insert进去的DNA切下来，共切四刀， 而不会切到vector本身带有的ampicillin resistent gene，第二个plasmid也是一样， 但只需切两刀，关於plasmid的设计都有用vector NTI作确认过了。 而我现在的目的就是要把pEGFP-C1上的EGFP gene给PCR出来clone到实验室现有的 vector上去做protein expression，因为pTTQ18 vector可以用E. coli 大量表现。 而positive control所用的DNA就是实验室现有的plasmids，所以是一定会长出来。 关於ligation条件，之前也有试过反应总体积20 uL，22度C、16度C和4度C都试过了， 就是长不出来。 至於为什麽只取ligation mixture 2 uL是因为参考molecular cloning的protocol， 怕万一取 10 uL 加入competent cells会影响到 transformation 的效率。 另外，CIP应该是要在切胶纯化前加还是切胶纯化後加呢？ 就我的认知假设vector在digestion反应完後进行切胶纯化後加CIP，这样一来CIP不就会 残留在vector的溶液里，这时如果直接拿去和insert DNA做ligation，这样insert DNA 不就也会被去磷酸根了，所以我才会选择vector在做完digestion後就直接加CIP反应， 反应完再切胶纯化。 以上补充希望有让大家更了解我的实验，只是我还是不知道是哪里出了问题 =.= 还是得用TA clone来纯化出我要的insert DNA会比较准确呢？ --

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