作者akongapple (阿康)
看板Biotech
標題[求救] Ligation 一直無法成功
時間Wed Apr 27 16:06:26 2011
關於ligation的相關問題，版上有許多資訊，有先爬了一下版上的相關資料，
可是我還是想不出我的問題出在哪裡，所以想PO上來請教一下大家，拜託大家了，
以下是我的實驗步驟：
Insert DNA：以pEGFP-C1為template，用自行設計的primers進行PCR，
primers上有設計好的restriction enzyme cutting sites，在cutting sites以外各有
預留了6 bp以上的sequence，以避免restriction enzyme無法辨認進行cutting，
PCR出來的長度共814 bp，因為我想利用一段PCR sequence做出兩種insert DNA，
所以PCR sequence包含有EGFP gene和兩個以上的restriction enzyme cutting sites，
也就是類似MCS的sequence。
經由EcoRI和HindIII切完後為793 bp為第一個insert DNA，而經由KpnI和HindIII切完後
為771 bp為第二個insert DNA，確認方式為跑agarose gel，主要是用2.5% agarose gel
進行確認，可以發現經由restriction enzyme反應後的band相較於PCR的band會位於較低
的位置，而切膠純化主要是用1.4% agarose gel，純化後的濃度大概在22 ng/uL左右，
另外純化後的insert DNA若單獨進行ligation後跑膠可以發現有形成dimer的band，
大約在1500 bp稍微上面一點的位置，因此應該可以證明insert DNA有確實地被
restriction enzyme進行cutting。
Vector DNA：主要是用實驗室現有的兩個plasmids，plasmids上面帶有ampicillin
resistent gene，而第一個plasmid可以被EcoRI和HindIII進行cutting，切完後的片段
為4512、725、509和47 bp，用 1.4% agarose gel跑膠後將4512 bp的band進行切膠
純化作為vector DNA；第二個plasmid可以被KpnI和HindIII進行cutting，
切完後的片段為4606和1265bp，一樣用1.4% agarose gel跑膠後將4606 bp的band進行
切膠純化後作為vector DNA，兩者在進行切膠純化前均有用CIP作處理，純化後的濃度
均約在50 ng/uL左右，另外純化後的vector DNA有單獨進行ligation後跑膠，發現並無
其他的band，只有在6557到4361 bp的marker間有single band。
Ligation reaction；先設定vector DNA為100 ng，依據molar ratio insert : vector =
1:1或3:1加入insert DNA，T4 ligase和buffer各加入 1 uL，反應體積為10 uL，
Total DNA amount約在100~150 ng左右，反應條件為4度C over night。
Transformation：取2 uL的ligation mixture加入50 uL的competent cells，冰上30 min
，42度C 40秒，冰上2 min，加入SOC medium 1 hr，取適量塗在含有ampicillin的LB
agar plate上，positive control為未進行digestion的plasmids，negative control
為digestion後的plasmid，結果positive control長出來的菌落超過50個，但是negative
control和ligation sample都沒有長出任何菌落。
以上條件已經重複約10次，做了快三個月了，均無法長出任何colony，請教大家這步驟是否有我未注意到
的地方呢？拜託大家了。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.97
1F：推 FENOR:clone做三個月...心有戚戚焉 04/27 16:51
2F：推 musicman:Insert:Vector 改成 4:1~5:1 另外,ligation的反應條件 04/27 17:19
3F：→ musicman:總反應體積改成 20ul, 在22度c反應2~3hr(NEB ligase) , 04/27 17:21
4F：→ musicman:vector 的 CIP 則不一定要做,取10ul去做transformation 04/27 17:23
5F：→ musicman: 如果有跑膠的圖可以看 比較好判斷~ 04/27 17:28
6F：→ yaprint:vector能切到那size 能代表100%兩酵素都有作用 要不要放 04/27 17:34
7F：→ yaprint:掉CIP 因為去除的不乾淨CIP卡在DNA上 不好接～ 04/27 17:34
8F：→ yaprint:你要不要也把單純vector加ligase的組別也transformation 04/27 17:35
9F：→ yaprint:理論上有insert組別的菌落扣掉這組的菌落 就是有你要的了 04/27 17:36
10F：推 iamwi:我做了半年了= = 每次咪聽都被酸~要花多久才能clone出來= = 04/27 17:50
11F：推 Realthugz:control那莫名菌落是甚麼 有挑來養看看嗎 雜菌? 04/27 17:50
12F：→ musicman:同 yap ,要做一組 vector only的control~ 04/27 18:34
13F：→ akongapple:不好意思補充一下，我的negative control就是用vector+ 04/27 18:43
14F：→ akongapple:ligase去做transformation的，沒有任何菌落長出來， 04/27 18:44
15F：→ akongapple:我想是因為vector為linear form且兩端都有經過CIP處理 04/27 18:45
16F：→ akongapple:所以不會self ligation，因此amipicillin resistent 04/27 18:45
17F：→ akongapple:gene無法表現，所以會長不出來，這也是我會什麼會拿來 04/27 18:46
18F：→ akongapple:當作negative control。 04/27 18:46
19F：推 datro:會不會是CIP沒去除乾淨? 已經切兩刀了 就不用CIP 直接接吧! 04/27 20:01
20F：推 conective:長不出來就不要CIP了...Insert：Vector比提高 04/27 21:26
21F：推 yaprint:那就別用cip吧 切了兩刀切膠回收 理論上長不出來的... 04/28 00:16
22F：推 a14743535:為什麼這樣會長不出來？？ 04/28 08:49
23F：→ a14743535:為什麼y大會說理論上長不出來?? 04/28 09:14
24F：→ yaprint:一個plasmid被切了兩刀 +ligase後vector沒辦法自接 04/28 12:44
25F：→ yaprint:接的起來就是有insert嚕 哈哈我沒說清楚怎樣長不出來 04/28 12:45
26F：推 a14743535:喔~~小弟現在也是遇到一樣的事情@@都長不出來 囧 04/28 15:31
27F：推 yaliu:其實....你的positive control plasmid沒切才長超過50顆而已 04/29 01:53
28F：→ yaliu:有點少耶....還是你有稀釋過再塗盤？理論尚未稀釋會是TNTC 04/29 01:54
29F：→ yaliu:還有也建議裡布需要作CIP啦～切位不一樣不用這一步沒關係 04/29 01:54
30F：→ yaliu:不曉得從哪看到的可能會CIP過頭切了不該切的之類的(只是聽說 04/29 01:56
31F：→ yaliu:CIP對我來說就是一整個很抽象阿～～ 04/29 01:58
32F：推 Realthugz:Cip確實不建議做太久呀 記得有教算量還反應時間 04/29 02:49
33F：推 alaric:T4 ligase reaction 條件, 可能不是一直在4度C. 05/02 01:45
34F：→ alaric:各家溫度稍微不同, 有22度C, 16度C, 更有人室溫20分. 05/02 01:46
35F：→ alaric:Transformation 取5ul ligation products+Host. 05/02 01:48
36F：推 mayjasty:ligation 的酵素有確認是否失活嗎 05/04 13:20