作者akongapple (阿康)
看板Biotech
标题[求救] Ligation 一直无法成功
时间Wed Apr 27 16:06:26 2011
关於ligation的相关问题，版上有许多资讯，有先爬了一下版上的相关资料，
可是我还是想不出我的问题出在哪里，所以想PO上来请教一下大家，拜托大家了，
以下是我的实验步骤：
Insert DNA：以pEGFP-C1为template，用自行设计的primers进行PCR，
primers上有设计好的restriction enzyme cutting sites，在cutting sites以外各有
预留了6 bp以上的sequence，以避免restriction enzyme无法辨认进行cutting，
PCR出来的长度共814 bp，因为我想利用一段PCR sequence做出两种insert DNA，
所以PCR sequence包含有EGFP gene和两个以上的restriction enzyme cutting sites，
也就是类似MCS的sequence。
经由EcoRI和HindIII切完後为793 bp为第一个insert DNA，而经由KpnI和HindIII切完後
为771 bp为第二个insert DNA，确认方式为跑agarose gel，主要是用2.5% agarose gel
进行确认，可以发现经由restriction enzyme反应後的band相较於PCR的band会位於较低
的位置，而切胶纯化主要是用1.4% agarose gel，纯化後的浓度大概在22 ng/uL左右，
另外纯化後的insert DNA若单独进行ligation後跑胶可以发现有形成dimer的band，
大约在1500 bp稍微上面一点的位置，因此应该可以证明insert DNA有确实地被
restriction enzyme进行cutting。
Vector DNA：主要是用实验室现有的两个plasmids，plasmids上面带有ampicillin
resistent gene，而第一个plasmid可以被EcoRI和HindIII进行cutting，切完後的片段
为4512、725、509和47 bp，用 1.4% agarose gel跑胶後将4512 bp的band进行切胶
纯化作为vector DNA；第二个plasmid可以被KpnI和HindIII进行cutting，
切完後的片段为4606和1265bp，一样用1.4% agarose gel跑胶後将4606 bp的band进行
切胶纯化後作为vector DNA，两者在进行切胶纯化前均有用CIP作处理，纯化後的浓度
均约在50 ng/uL左右，另外纯化後的vector DNA有单独进行ligation後跑胶，发现并无
其他的band，只有在6557到4361 bp的marker间有single band。
Ligation reaction；先设定vector DNA为100 ng，依据molar ratio insert : vector =
1:1或3:1加入insert DNA，T4 ligase和buffer各加入 1 uL，反应体积为10 uL，
Total DNA amount约在100~150 ng左右，反应条件为4度C over night。
Transformation：取2 uL的ligation mixture加入50 uL的competent cells，冰上30 min
，42度C 40秒，冰上2 min，加入SOC medium 1 hr，取适量涂在含有ampicillin的LB
agar plate上，positive control为未进行digestion的plasmids，negative control
为digestion後的plasmid，结果positive control长出来的菌落超过50个，但是negative
control和ligation sample都没有长出任何菌落。
以上条件已经重复约10次，做了快三个月了，均无法长出任何colony，请教大家这步骤是否有我未注意到
的地方呢？拜托大家了。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.97
1F：推 FENOR:clone做三个月...心有戚戚焉 04/27 16:51
2F：推 musicman:Insert:Vector 改成 4:1~5:1 另外,ligation的反应条件 04/27 17:19
3F：→ musicman:总反应体积改成 20ul, 在22度c反应2~3hr(NEB ligase) , 04/27 17:21
4F：→ musicman:vector 的 CIP 则不一定要做,取10ul去做transformation 04/27 17:23
5F：→ musicman: 如果有跑胶的图可以看 比较好判断~ 04/27 17:28
6F：→ yaprint:vector能切到那size 能代表100%两酵素都有作用 要不要放 04/27 17:34
7F：→ yaprint:掉CIP 因为去除的不乾净CIP卡在DNA上 不好接～ 04/27 17:34
8F：→ yaprint:你要不要也把单纯vector加ligase的组别也transformation 04/27 17:35
9F：→ yaprint:理论上有insert组别的菌落扣掉这组的菌落 就是有你要的了 04/27 17:36
10F：推 iamwi:我做了半年了= = 每次咪听都被酸~要花多久才能clone出来= = 04/27 17:50
11F：推 Realthugz:control那莫名菌落是甚麽 有挑来养看看吗 杂菌? 04/27 17:50
12F：→ musicman:同 yap ,要做一组 vector only的control~ 04/27 18:34
13F：→ akongapple:不好意思补充一下，我的negative control就是用vector+ 04/27 18:43
14F：→ akongapple:ligase去做transformation的，没有任何菌落长出来， 04/27 18:44
15F：→ akongapple:我想是因为vector为linear form且两端都有经过CIP处理 04/27 18:45
16F：→ akongapple:所以不会self ligation，因此amipicillin resistent 04/27 18:45
17F：→ akongapple:gene无法表现，所以会长不出来，这也是我会什麽会拿来 04/27 18:46
18F：→ akongapple:当作negative control。 04/27 18:46
19F：推 datro:会不会是CIP没去除乾净? 已经切两刀了 就不用CIP 直接接吧! 04/27 20:01
20F：推 conective:长不出来就不要CIP了...Insert：Vector比提高 04/27 21:26
21F：推 yaprint:那就别用cip吧 切了两刀切胶回收 理论上长不出来的... 04/28 00:16
22F：推 a14743535:为什麽这样会长不出来？？ 04/28 08:49
23F：→ a14743535:为什麽y大会说理论上长不出来?? 04/28 09:14
24F：→ yaprint:一个plasmid被切了两刀 +ligase後vector没办法自接 04/28 12:44
25F：→ yaprint:接的起来就是有insert噜 哈哈我没说清楚怎样长不出来 04/28 12:45
26F：推 a14743535:喔~~小弟现在也是遇到一样的事情@@都长不出来 囧 04/28 15:31
27F：推 yaliu:其实....你的positive control plasmid没切才长超过50颗而已 04/29 01:53
28F：→ yaliu:有点少耶....还是你有稀释过再涂盘？理论尚未稀释会是TNTC 04/29 01:54
29F：→ yaliu:还有也建议里布需要作CIP啦～切位不一样不用这一步没关系 04/29 01:54
30F：→ yaliu:不晓得从哪看到的可能会CIP过头切了不该切的之类的(只是听说 04/29 01:56
31F：→ yaliu:CIP对我来说就是一整个很抽象阿～～ 04/29 01:58
32F：推 Realthugz:Cip确实不建议做太久呀 记得有教算量还反应时间 04/29 02:49
33F：推 alaric:T4 ligase reaction 条件, 可能不是一直在4度C. 05/02 01:45
34F：→ alaric:各家温度稍微不同, 有22度C, 16度C, 更有人室温20分. 05/02 01:46
35F：→ alaric:Transformation 取5ul ligation products+Host. 05/02 01:48
36F：推 mayjasty:ligation 的酵素有确认是否失活吗 05/04 13:20