作者alicialai (Fairy Monster)
看板Biotech
標題[求救] Cloning
時間Mon Apr 18 07:35:19 2011
Hello, 大家早, 最近face到很annoy的問題,
我想了半天都想不出辦法來, 請大家幫忙解惑..
實驗步驟大致上是這樣,
因為我的final construct have to be in pDM4 vector (7kb)
但是因為這傢伙很胖+copy number低,
所以我選擇先在pBluescript上做construct.
我的final produc in pBluescript 是3kb (2個片段+一個antibiotic marker(Tet))
很不幸的, pBluescript也是3kb, 造成我無法用enzyme分開,
(other enzyme in pBS lab沒有, 新訂enzyme是最後的辦法)
所以我的處理是用respected enzyme切後直接purified做ligation,
之後用double antibiotics marker selection.
Tet(另外接進去的) and Cm which is the marker for pDM4,
這樣便可以殺掉self-ligation (指insert接回去pBS).
然後問題就來了!
Transform後隔天有colony, colony PCR (pDM4 primer) is positive.
但我inoculate to liquid LB之後他就不長了,
但同樣的colony我restreak on new plate(2 antibiotics)就長得很開心,
試了兩次都這樣... very annoyed!!!!!
想請問大家有沒有碰過類似的問題以及有沒有建議的方法呢?
感謝大家憂^__________________________^
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 130.194.92.116
1F：→ Invec:只有我看不懂原po在寫什麼嗎...? 04/18 09:27
2F：→ milkpa:我suggest你在養liduid的時候decrease抗生素to 1/2 or1/3量 04/18 09:37
3F：→ Invec:針對cloning,完成pBluescript的建構後,用M13 F+R和 pfu酵素 04/18 09:48
4F：→ Invec:作一次PCR再用限制酵素切就能得到你要的組合片段了 04/18 09:49
5F：→ Invec:pfu, M13 F+R primers 應該連隔壁實驗室都借得到... 04/18 09:51
6F：→ soom:找看看有沒有pBluescript上有而insert沒有的RE切位 04/18 12:42
7F：推 conective:中英文參雜個人認為不好閱讀 真正的專有名詞寫英文就夠 04/18 13:13
8F：→ alicialai:謝謝大家... 04/18 19:07
9F：→ alicialai:抱歉中英文參雜, 我想打中文, 可是我的中文快忘光了.. 04/18 19:13
10F：→ alicialai:起先我想打英文, 可是我想應該更少人會看吧 04/18 19:15
11F：→ alicialai:抱歉造成閱讀困難.. 我下次用google翻譯好了 04/18 19:17
12F：→ alicialai:and, 我只是希望能解決問題, 並沒有其他的意思 04/18 19:18
13F：→ turtle24:google翻譯會比現在更難閱讀唷 XD 04/19 01:04
14F：推 yaliu:想建議你medium and plate去確認一下是否OK~ 04/19 01:59
15F：→ yaliu:liquid是完全不長還是長得不好？ 04/19 02:00
16F：→ yaliu:plate可以liquid不行，挺矛盾的.... 04/19 02:01
17F：推 huhu126:1.換E.coli strain, 2. 使用rich medium 再試試 04/19 02:06
18F：推 mattmatt:colony長在plate上和菌懸浮在LB裡面 抗生素實際作用濃度 04/19 07:15
19F：→ mattmatt:會有落差 液態裡面菌體分散 抗生素很容易抑制"每一個"菌 04/19 07:16
20F：→ mattmatt:菌體來不及生產兩種抗抗生素就會被殺死 04/19 07:17
21F：→ mattmatt:建議你plate上先用兩種抗生素篩選 挑出single colony後 04/19 07:18
22F：→ mattmatt:液態用你接進去的抗生素(Tet)一種就好 04/19 07:19
23F：→ mattmatt:液態用兩種的話濃度都減半 不然菌會長得很慢 甚至不長 04/19 07:21
24F：推 bider:你有沒有辦法找到pbluescript有的但是target seq沒的RE site 04/19 07:38
25F：→ bider:多切一種酵素 讓片段可以分開 04/19 07:39
26F：推 Realthugz:真好奇你是哪國人 04/25 05:04