作者alicialai (Fairy Monster)
看板Biotech
标题[求救] Cloning
时间Mon Apr 18 07:35:19 2011
Hello, 大家早, 最近face到很annoy的问题,
我想了半天都想不出办法来, 请大家帮忙解惑..
实验步骤大致上是这样,
因为我的final construct have to be in pDM4 vector (7kb)
但是因为这家伙很胖+copy number低,
所以我选择先在pBluescript上做construct.
我的final produc in pBluescript 是3kb (2个片段+一个antibiotic marker(Tet))
很不幸的, pBluescript也是3kb, 造成我无法用enzyme分开,
(other enzyme in pBS lab没有, 新订enzyme是最後的办法)
所以我的处理是用respected enzyme切後直接purified做ligation,
之後用double antibiotics marker selection.
Tet(另外接进去的) and Cm which is the marker for pDM4,
这样便可以杀掉self-ligation (指insert接回去pBS).
然後问题就来了!
Transform後隔天有colony, colony PCR (pDM4 primer) is positive.
但我inoculate to liquid LB之後他就不长了,
但同样的colony我restreak on new plate(2 antibiotics)就长得很开心,
试了两次都这样... very annoyed!!!!!
想请问大家有没有碰过类似的问题以及有没有建议的方法呢?
感谢大家忧^__________________________^
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 130.194.92.116
1F：→ Invec:只有我看不懂原po在写什麽吗...? 04/18 09:27
2F：→ milkpa:我suggest你在养liduid的时候decrease抗生素to 1/2 or1/3量 04/18 09:37
3F：→ Invec:针对cloning,完成pBluescript的建构後,用M13 F+R和 pfu酵素 04/18 09:48
4F：→ Invec:作一次PCR再用限制酵素切就能得到你要的组合片段了 04/18 09:49
5F：→ Invec:pfu, M13 F+R primers 应该连隔壁实验室都借得到... 04/18 09:51
6F：→ soom:找看看有没有pBluescript上有而insert没有的RE切位 04/18 12:42
7F：推 conective:中英文参杂个人认为不好阅读 真正的专有名词写英文就够 04/18 13:13
8F：→ alicialai:谢谢大家... 04/18 19:07
9F：→ alicialai:抱歉中英文参杂, 我想打中文, 可是我的中文快忘光了.. 04/18 19:13
10F：→ alicialai:起先我想打英文, 可是我想应该更少人会看吧 04/18 19:15
11F：→ alicialai:抱歉造成阅读困难.. 我下次用google翻译好了 04/18 19:17
12F：→ alicialai:and, 我只是希望能解决问题, 并没有其他的意思 04/18 19:18
13F：→ turtle24:google翻译会比现在更难阅读唷 XD 04/19 01:04
14F：推 yaliu:想建议你medium and plate去确认一下是否OK~ 04/19 01:59
15F：→ yaliu:liquid是完全不长还是长得不好？ 04/19 02:00
16F：→ yaliu:plate可以liquid不行，挺矛盾的.... 04/19 02:01
17F：推 huhu126:1.换E.coli strain, 2. 使用rich medium 再试试 04/19 02:06
18F：推 mattmatt:colony长在plate上和菌悬浮在LB里面 抗生素实际作用浓度 04/19 07:15
19F：→ mattmatt:会有落差 液态里面菌体分散 抗生素很容易抑制"每一个"菌 04/19 07:16
20F：→ mattmatt:菌体来不及生产两种抗抗生素就会被杀死 04/19 07:17
21F：→ mattmatt:建议你plate上先用两种抗生素筛选 挑出single colony後 04/19 07:18
22F：→ mattmatt:液态用你接进去的抗生素(Tet)一种就好 04/19 07:19
23F：→ mattmatt:液态用两种的话浓度都减半 不然菌会长得很慢 甚至不长 04/19 07:21
24F：推 bider:你有没有办法找到pbluescript有的但是target seq没的RE site 04/19 07:38
25F：→ bider:多切一种酵素 让片段可以分开 04/19 07:39
26F：推 Realthugz:真好奇你是哪国人 04/25 05:04