作者whyneeds (Lu-lin)
看板Biotech
標題[求救] real-time qPCR
時間Sun Apr 17 18:40:33 2011
大家好,我使用的儀器是real-time qPCR,進行環境中特定細菌的定量分析.
使用的reagents是TaqMan peobe, Roche probe master.
起初,發現檢量線於低濃度的Ct值上不去,會漸漸趨於平緩而非高濃度呈等比放大.
且,NTC明顯與趨於平緩的Ct值相近(約35-36),很明顯就是被汙染了.
我後來以兩種方式配置reagents:
1.將各種試劑單獨加於每個well,發現NTC值不見了,表示reagnets應該沒有被汙染吧!
但是,檢量線低濃度部分仍然上不去.
2.將每個well的reagents先配置於eppendorf內,再分裝.
結果,NTC全部都跑出來了,且數值皆為35-36之間.
另外,檢量線低濃度部分也上不去,數值也約為35-36.
我tip和pipetman都有更換過了呀!
可是,仍然找不到原因:(
想請問專業的大家,可以給我什建議作為改善嗎?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.217.48.153
1F：推 mattmatt:不懂檢量線低濃度是甚麼意思? 另外total cycle數是多少? 04/17 21:59
2F：→ whyneeds:序列稀釋高濃度至低濃度(0.01fg)，總cycle為50,謝謝! 04/17 22:36
3F：推 mattmatt:可能要看過raw data才能確認是甚麼狀況 04/17 22:57
4F：→ mattmatt:但我個人覺得 NTC與低濃度跑出來的35-36的數值 04/17 22:58
5F：→ mattmatt:曲線又沒有好的斜率 有可能是primer dimer自己放大的產物 04/17 22:59
6F：→ mattmatt:或是probe與primer之間的反應 04/17 23:00
7F：→ Anvec:嗯 有可能是 primer dimer 跑個膠看看位置是不是很低 04/17 23:02
8F：→ Anvec:或是用軟體比看看有沒有機會出現 primer dimer 04/17 23:03
9F：推 mattmatt:而不是真正target造成的訊號 04/17 23:04
10F：→ mattmatt:不知你有沒有跑melting curve的圖 也許可以參考 04/17 23:04
11F：→ mattmatt:另外濃度低到0.01fg可以說是超過real time PCR的極限了 04/17 23:06
12F：→ mattmatt:primer&probe找不到目標 就跟NTC一樣結果 04/17 23:07
13F：→ mattmatt:然後primer & probe自己亂搞了起來 04/17 23:07
14F：→ whyneeds:謝謝mattmatt很快速的回覆我!可是我使用的是TaqMan probe 04/17 23:08
15F：→ whyneeds:是不是不會有primer dimer的問題發生?且不須要跑melting 04/17 23:09
16F：→ mattmatt:若老板可接受primer dimer訊號的話 這個結果算是正常現象 04/17 23:09
17F：→ mattmatt:若不接受的話 就考慮換primer & probe了 04/17 23:09
18F：→ whyneeds:curve? 可是以前學姊還可以跑到0.001fg!!因為是環境監測 04/17 23:10
19F：→ mattmatt:還是有機會有 有可能是primer dimer產物先被放大 04/17 23:11
20F：→ mattmatt:好死不死probe剛好會去hybrid到 到後面幾輪訊號就出現了 04/17 23:11
21F：→ whyneeds:所以濃度的要求都要很低,補充以前學姊的Ct值可以到40. 04/17 23:11
22F：推 mattmatt:請問是Roche Lightcycler 毛細管機型嗎....? 04/17 23:14
23F：→ whyneeds:也謝謝Anvec的建議! 04/17 23:16
24F：→ whyneeds:不,是Roche480 04/17 23:18
25F：→ whyneeds:而且,現在很怪的是reagent配置的方式也會影響NTC的結果. 04/17 23:20
26F：→ whyneeds:但,我又不可能每次跑80多個樣本都一個well一個well加試劑 04/17 23:21