作者whyneeds (Lu-lin)
看板Biotech
标题[求救] real-time qPCR
时间Sun Apr 17 18:40:33 2011
大家好,我使用的仪器是real-time qPCR,进行环境中特定细菌的定量分析.
使用的reagents是TaqMan peobe, Roche probe master.
起初,发现检量线於低浓度的Ct值上不去,会渐渐趋於平缓而非高浓度呈等比放大.
且,NTC明显与趋於平缓的Ct值相近(约35-36),很明显就是被污染了.
我後来以两种方式配置reagents:
1.将各种试剂单独加於每个well,发现NTC值不见了,表示reagnets应该没有被污染吧!
但是,检量线低浓度部分仍然上不去.
2.将每个well的reagents先配置於eppendorf内,再分装.
结果,NTC全部都跑出来了,且数值皆为35-36之间.
另外,检量线低浓度部分也上不去,数值也约为35-36.
我tip和pipetman都有更换过了呀!
可是,仍然找不到原因:(
想请问专业的大家,可以给我什建议作为改善吗?
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◆ From: 61.217.48.153
1F：推 mattmatt:不懂检量线低浓度是甚麽意思? 另外total cycle数是多少? 04/17 21:59
2F：→ whyneeds:序列稀释高浓度至低浓度(0.01fg)，总cycle为50,谢谢! 04/17 22:36
3F：推 mattmatt:可能要看过raw data才能确认是甚麽状况 04/17 22:57
4F：→ mattmatt:但我个人觉得 NTC与低浓度跑出来的35-36的数值 04/17 22:58
5F：→ mattmatt:曲线又没有好的斜率 有可能是primer dimer自己放大的产物 04/17 22:59
6F：→ mattmatt:或是probe与primer之间的反应 04/17 23:00
7F：→ Anvec:嗯 有可能是 primer dimer 跑个胶看看位置是不是很低 04/17 23:02
8F：→ Anvec:或是用软体比看看有没有机会出现 primer dimer 04/17 23:03
9F：推 mattmatt:而不是真正target造成的讯号 04/17 23:04
10F：→ mattmatt:不知你有没有跑melting curve的图 也许可以参考 04/17 23:04
11F：→ mattmatt:另外浓度低到0.01fg可以说是超过real time PCR的极限了 04/17 23:06
12F：→ mattmatt:primer&probe找不到目标 就跟NTC一样结果 04/17 23:07
13F：→ mattmatt:然後primer & probe自己乱搞了起来 04/17 23:07
14F：→ whyneeds:谢谢mattmatt很快速的回覆我!可是我使用的是TaqMan probe 04/17 23:08
15F：→ whyneeds:是不是不会有primer dimer的问题发生?且不须要跑melting 04/17 23:09
16F：→ mattmatt:若老板可接受primer dimer讯号的话 这个结果算是正常现象 04/17 23:09
17F：→ mattmatt:若不接受的话 就考虑换primer & probe了 04/17 23:09
18F：→ whyneeds:curve? 可是以前学姊还可以跑到0.001fg!!因为是环境监测 04/17 23:10
19F：→ mattmatt:还是有机会有 有可能是primer dimer产物先被放大 04/17 23:11
20F：→ mattmatt:好死不死probe刚好会去hybrid到 到後面几轮讯号就出现了 04/17 23:11
21F：→ whyneeds:所以浓度的要求都要很低,补充以前学姊的Ct值可以到40. 04/17 23:11
22F：推 mattmatt:请问是Roche Lightcycler 毛细管机型吗....? 04/17 23:14
23F：→ whyneeds:也谢谢Anvec的建议! 04/17 23:16
24F：→ whyneeds:不,是Roche480 04/17 23:18
25F：→ whyneeds:而且,现在很怪的是reagent配置的方式也会影响NTC的结果. 04/17 23:20
26F：→ whyneeds:但,我又不可能每次跑80多个样本都一个well一个well加试剂 04/17 23:21