作者chong (CW)
看板Biotech
標題[求救] 硫酸銨沉澱中蛋白質回收的問題
時間Sat Apr 16 11:24:26 2011
最近在實驗室中做乳酸菌中蛋白質萃取實驗，我們是用發酵槽發酵乳酸菌，
加入1% lysozyme進行破菌，再以硫酸銨沉澱從上清液中收取蛋白質。收集到蛋白質
後，用Bio-Red的Duo flow跑離子交換樹脂。
通常一次發酵能獲得30g的菌泥，我把它分成2部分，每1部分加300ml tris(ph8)，
再加入3g lysozyme，於4℃冰箱中反應2小時。
→由於lysozyme剛加到tris buffer中時，不會馬上溶解，而且容易形成塊狀，
實驗室其他人覺得可以先將lysozyme配成溶液後，再加到含菌的tris buffer中，
這步驟會影響破菌的效果嗎？
反應2小時後，離心22500g、30分鐘、4℃，收集上清液，然後開始做硫酸銨沉澱。
實驗室用的是JT.backer的硫酸銨，顆粒有點大，所以我會先用研缽磨碎，才加到
上清液中，加的時候緩慢加，可是我覺得很難保證每次做這實驗時的手法都很固定，
有時候可能加稍微快一點，有時候會稍微慢一點，就是緩慢將那些粉末加到上清液中，
然後讓它繼續攪拌，接著離心收集沉澱物。
現在最大的問題就在於每批硫酸銨沉澱後的蛋白質，跑完離子交換樹脂後，
獲得的圖譜不完全一致，pick高低會有落差，可是實驗室大老闆要求每批蛋白質
跑ion exchange的pick都要一致，才能將它們混合以進行後續實驗。因為在後續
實驗中，有打算進行動物餵食實驗，所以需要較大的量。
因為之前做硫酸銨沉澱的人已經不在實驗室，所以我們是自己摸索著做，
造成ion exchange的pick不一致的原因，會是硫酸銨沉澱造成的嗎？
想請教有這方面經驗的人，能否給點意見？謝謝。
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◆ From: 124.219.13.192
1F：推 micocat:我們家lysozyme都是先配成液體再使用的 04/16 12:43
2F：→ micocat:硫酸銨沈澱是靠鹽濃度來沈蛋白 只要最後有全溶掉就可以了 04/16 12:45
3F：→ Anvec:你們有沒有做透析去除硫酸銨呀? 04/17 01:48
4F：推 mattmatt:我們實驗室也是JTBacker的粗顆粒硫酸銨 04/17 22:06
5F：→ mattmatt:因為收全蛋白所以直接把秤好的硫酸銨一次加下去 04/17 22:07
6F：→ mattmatt:4度c攪拌overnight 讓他全部融解 並達到動態平衡 04/17 22:07
7F：→ mattmatt:顆粒比較粗 溶解的也比較慢 收起蛋白都OK 04/17 22:08
8F：→ mattmatt:同Anvec 不知你們收完有沒有用通column的buffer做透析? 04/17 22:10
9F：→ chong:有啊，有做透析。我們收集4個硫酸銨濃度：0~25、25~50、 04/19 20:37
10F：→ chong:50~75及75~100，所以不能一次全加，只能慢慢加，好累！ 04/19 20:37