作者chong (CW)
看板Biotech
标题[求救] 硫酸铵沉淀中蛋白质回收的问题
时间Sat Apr 16 11:24:26 2011
最近在实验室中做乳酸菌中蛋白质萃取实验，我们是用发酵槽发酵乳酸菌，
加入1% lysozyme进行破菌，再以硫酸铵沉淀从上清液中收取蛋白质。收集到蛋白质
後，用Bio-Red的Duo flow跑离子交换树脂。
通常一次发酵能获得30g的菌泥，我把它分成2部分，每1部分加300ml tris(ph8)，
再加入3g lysozyme，於4℃冰箱中反应2小时。
→由於lysozyme刚加到tris buffer中时，不会马上溶解，而且容易形成块状，
实验室其他人觉得可以先将lysozyme配成溶液後，再加到含菌的tris buffer中，
这步骤会影响破菌的效果吗？
反应2小时後，离心22500g、30分钟、4℃，收集上清液，然後开始做硫酸铵沉淀。
实验室用的是JT.backer的硫酸铵，颗粒有点大，所以我会先用研钵磨碎，才加到
上清液中，加的时候缓慢加，可是我觉得很难保证每次做这实验时的手法都很固定，
有时候可能加稍微快一点，有时候会稍微慢一点，就是缓慢将那些粉末加到上清液中，
然後让它继续搅拌，接着离心收集沉淀物。
现在最大的问题就在於每批硫酸铵沉淀後的蛋白质，跑完离子交换树脂後，
获得的图谱不完全一致，pick高低会有落差，可是实验室大老板要求每批蛋白质
跑ion exchange的pick都要一致，才能将它们混合以进行後续实验。因为在後续
实验中，有打算进行动物喂食实验，所以需要较大的量。
因为之前做硫酸铵沉淀的人已经不在实验室，所以我们是自己摸索着做，
造成ion exchange的pick不一致的原因，会是硫酸铵沉淀造成的吗？
想请教有这方面经验的人，能否给点意见？谢谢。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 124.219.13.192
1F：推 micocat:我们家lysozyme都是先配成液体再使用的 04/16 12:43
2F：→ micocat:硫酸铵沈淀是靠盐浓度来沈蛋白 只要最後有全溶掉就可以了 04/16 12:45
3F：→ Anvec:你们有没有做透析去除硫酸铵呀? 04/17 01:48
4F：推 mattmatt:我们实验室也是JTBacker的粗颗粒硫酸铵 04/17 22:06
5F：→ mattmatt:因为收全蛋白所以直接把秤好的硫酸铵一次加下去 04/17 22:07
6F：→ mattmatt:4度c搅拌overnight 让他全部融解 并达到动态平衡 04/17 22:07
7F：→ mattmatt:颗粒比较粗 溶解的也比较慢 收起蛋白都OK 04/17 22:08
8F：→ mattmatt:同Anvec 不知你们收完有没有用通column的buffer做透析? 04/17 22:10
9F：→ chong:有啊，有做透析。我们收集4个硫酸铵浓度：0~25、25~50、 04/19 20:37
10F：→ chong:50~75及75~100，所以不能一次全加，只能慢慢加，好累！ 04/19 20:37