作者drops09 (drops09)
看板Biotech
標題[求救] SDS-PAGE跑出來的protein大小與MS結果不符合?
時間Thu Apr 14 00:49:05 2011
各位好,
最近在做SDS-PAGE(12%,sample有加2-ME)
由於想要鑑定表現量有差異的protein,
所以之後以LC-MS/MS(orbitrap)作分析
因為是一維的band所以一定不止只有一種protein.
但是結果讓我很困惑...
如果是切50k的band但是有對到一些比50k大的protein應該算正常,
因為可能是一些subunit,或是打斷雙硫鍵的片段.
但比如我是切100k的band去鑑定,但結果卻有對到30K的protein,或是70k的albumin等等
如果denature沒完全有差那麼多嗎?modification應該也不是這樣阿?
甚至有些band連質量差不多相符的protein都沒有..不是比切的位置大要不就是小很多
但MS靈敏度高,的確是證實有這些protein...(已去除false positive)!
謝謝各位看完~~
請各位高手解惑~~感謝!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.57.154.131
1F：推 leoblack:你切膠時有可能污染到,MS最常打到的不就是keratine?! 04/14 01:32
2F：→ drops09:應該不是..因為沒有keratin..不符的那些protein也不可能出 04/14 02:27
3F：→ drops09:現在手上,而且我已經是在hood內切膠及水解. 04/14 02:28
4F：→ drops09:再說,band很明顯,即使有些許汙染,訊號仍會被蓋過去 04/14 02:31
5F：推 kingtiger:其實有些peptide的特異性比較低,在很多蛋白都有 04/15 01:48
6F：→ kingtiger:做蛋白質體的,要看你的peptide能認到多少比例 04/15 01:50
7F：→ drops09:的確...但若以上述例子來說,如果30K比100K的coverage高很 04/15 10:48
8F：→ drops09:多的話,要怎麼解釋? 04/15 10:49
9F：→ Anvec:我沒有看到你的 data 所以我只能就我的經驗推猜一下 04/15 16:35
10F：→ Anvec:30kDa 跟 100kDa 的蛋白質長度若以 aa. 的平均分子量 110 算 04/15 16:37
11F：→ Anvec:前者約 270 aa. 後者約 900 aa. 差不多就是三倍多的差異 04/15 16:37
12F：→ Anvec:如果你的樣品有用 trypsin 做 digestion 04/15 16:39
13F：→ Anvec:切出來的片段大小平均會接近 10 aa. 04/15 16:40
14F：→ Anvec:假設質譜結果各有一條 10aa. peptide 對到 30kDa 跟 100kDa 04/15 16:41
15F：→ Anvec:前者 coverage 是 3.7% 後者是 1% 04/15 16:41
16F：→ Anvec:所以 coverage 只是拿來參考用的 04/15 16:44
17F：→ Anvec:又假設兩個 coverage 都是 3% 但 100kDa 是由三條 peptide 04/15 16:46
18F：→ Anvec:比對出來的 那雖然都是 3% 當然 100kDa 的可能性會比較高 04/15 16:47
19F：→ Anvec:所以除了看 coverage 的程度外 還要看有多少片段比對到 04/15 16:47
20F：→ drops09:感謝樓上為我解說~你說的意思我懂...我又看了一下Data... 04/15 23:26
21F：→ drops09:去除比對後誤差較大的片段,比對到的片段大約佔各自的1/3.. 04/15 23:31
22F：→ Anvec:最直接確認的辦法就是去借抗體 04/17 01:45