作者drops09 (drops09)
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标题[求救] SDS-PAGE跑出来的protein大小与MS结果不符合?
时间Thu Apr 14 00:49:05 2011
各位好,
最近在做SDS-PAGE(12%,sample有加2-ME)
由於想要监定表现量有差异的protein,
所以之後以LC-MS/MS(orbitrap)作分析
因为是一维的band所以一定不止只有一种protein.
但是结果让我很困惑...
如果是切50k的band但是有对到一些比50k大的protein应该算正常,
因为可能是一些subunit,或是打断双硫键的片段.
但比如我是切100k的band去监定,但结果却有对到30K的protein,或是70k的albumin等等
如果denature没完全有差那麽多吗?modification应该也不是这样阿?
甚至有些band连质量差不多相符的protein都没有..不是比切的位置大要不就是小很多
但MS灵敏度高,的确是证实有这些protein...(已去除false positive)!
谢谢各位看完~~
请各位高手解惑~~感谢!
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◆ From: 61.57.154.131
1F：推 leoblack:你切胶时有可能污染到,MS最常打到的不就是keratine?! 04/14 01:32
2F：→ drops09:应该不是..因为没有keratin..不符的那些protein也不可能出 04/14 02:27
3F：→ drops09:现在手上,而且我已经是在hood内切胶及水解. 04/14 02:28
4F：→ drops09:再说,band很明显,即使有些许污染,讯号仍会被盖过去 04/14 02:31
5F：推 kingtiger:其实有些peptide的特异性比较低,在很多蛋白都有 04/15 01:48
6F：→ kingtiger:做蛋白质体的,要看你的peptide能认到多少比例 04/15 01:50
7F：→ drops09:的确...但若以上述例子来说,如果30K比100K的coverage高很 04/15 10:48
8F：→ drops09:多的话,要怎麽解释? 04/15 10:49
9F：→ Anvec:我没有看到你的 data 所以我只能就我的经验推猜一下 04/15 16:35
10F：→ Anvec:30kDa 跟 100kDa 的蛋白质长度若以 aa. 的平均分子量 110 算 04/15 16:37
11F：→ Anvec:前者约 270 aa. 後者约 900 aa. 差不多就是三倍多的差异 04/15 16:37
12F：→ Anvec:如果你的样品有用 trypsin 做 digestion 04/15 16:39
13F：→ Anvec:切出来的片段大小平均会接近 10 aa. 04/15 16:40
14F：→ Anvec:假设质谱结果各有一条 10aa. peptide 对到 30kDa 跟 100kDa 04/15 16:41
15F：→ Anvec:前者 coverage 是 3.7% 後者是 1% 04/15 16:41
16F：→ Anvec:所以 coverage 只是拿来参考用的 04/15 16:44
17F：→ Anvec:又假设两个 coverage 都是 3% 但 100kDa 是由三条 peptide 04/15 16:46
18F：→ Anvec:比对出来的 那虽然都是 3% 当然 100kDa 的可能性会比较高 04/15 16:47
19F：→ Anvec:所以除了看 coverage 的程度外 还要看有多少片段比对到 04/15 16:47
20F：→ drops09:感谢楼上为我解说~你说的意思我懂...我又看了一下Data... 04/15 23:26
21F：→ drops09:去除比对後误差较大的片段,比对到的片段大约占各自的1/3.. 04/15 23:31
22F：→ Anvec:最直接确认的办法就是去借抗体 04/17 01:45