作者FUJI0904 (FUJI0904)
看板Biotech
標題[方法] 使用Western blot看 protein dimer
時間Tue Apr 12 13:19:06 2011
先感謝之前發文時回覆我的各位。
由於老闆要我先安排之後的實驗，設計好要報給她和大家聽
上一篇有說過，我做的是藥物 treat 後看 apoptosis 的關聯與影響
老闆要我先確定該藥物會否走 ROS → mitochondria membrane dysfunction 的路徑
所以在 cell cycle 和 WB 測 caspase 3 活化程度後，如果有好的結果
可能要用染劑 JC-1 和 DCF-DA 測 mitochondria membrane potential 和 ROS
但老闆也說要我看看 Bcl-2 表現與 conformational change 和 Bax 的 "dimerization"
我知道 Bax 的 "dimerization" 應該可以用 gel filtration 來看
但老闆說她看過有 paper 說做粒線體分離再用 WB 看就好，似乎她也沒有很想買 kit，叫
我查看看
我是有查到的確有paper這樣做，粒線體分離出來後用不含 2-Me 和 DTT 的buffer lysis
並跑 nonreducing gel，我的感覺是為了避免打斷 Bax dimer 間的雙硫鍵
但 paper 又說：
Cell lysis and the denaturing electrophoretic run were performed in
nonreducing conditions (i.e., DTT and β-mercaptoethanol were omitted, respectively) to preserve
eventual disulfides.
這樣的意思到底是要不要加熱作 denature 呢？
如要，加熱就不會打斷雙硫鍵破壞 dimer 嗎？
懇請能人前被指教，感激不盡 <(_ _)>
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.117.39.44
1F：→ trumpet:non-reducing也是要加熱讓反應完全些，只是不含DTT or 2ME 04/12 14:59
2F：→ jsi:我最近也在跑non-reducing gel,使用不含DTT或2ME的loading dye 04/12 23:15
3F：→ jsi:sample不加熱，gel配置沒有改變，可偵測到dimer 04/12 23:16
4F：→ jsi:抱歉~是non-reducing condition不是non-reducing gel... 04/12 23:19
5F：→ FUJI0904:那請問在抽蛋白時，有些buffer會含 1~2 mM 的 DTT (可能 04/12 23:30
6F：→ FUJI0904:是當作保護吧...這部份的DTT也不要加嗎？ 還是其實影響 04/12 23:31
7F：→ FUJI0904:不大呢？ 感謝j大 04/12 23:32
9F：→ jsi:避免使用DTT，但有時候理論跟實際也不一定相符XD 試了就知道 04/12 23:49
10F：→ FUJI0904:所以j大抽蛋白時有添加 DTT 或 B-Me 嗎? 04/13 00:17
11F：→ jsi:沒有添加DTT or B-Me 04/14 01:20