作者FUJI0904 (FUJI0904)
看板Biotech
标题[方法] 使用Western blot看 protein dimer
时间Tue Apr 12 13:19:06 2011
先感谢之前发文时回覆我的各位。
由於老板要我先安排之後的实验，设计好要报给她和大家听
上一篇有说过，我做的是药物 treat 後看 apoptosis 的关联与影响
老板要我先确定该药物会否走 ROS → mitochondria membrane dysfunction 的路径
所以在 cell cycle 和 WB 测 caspase 3 活化程度後，如果有好的结果
可能要用染剂 JC-1 和 DCF-DA 测 mitochondria membrane potential 和 ROS
但老板也说要我看看 Bcl-2 表现与 conformational change 和 Bax 的 "dimerization"
我知道 Bax 的 "dimerization" 应该可以用 gel filtration 来看
但老板说她看过有 paper 说做粒线体分离再用 WB 看就好，似乎她也没有很想买 kit，叫
我查看看
我是有查到的确有paper这样做，粒线体分离出来後用不含 2-Me 和 DTT 的buffer lysis
并跑 nonreducing gel，我的感觉是为了避免打断 Bax dimer 间的双硫键
但 paper 又说：
Cell lysis and the denaturing electrophoretic run were performed in
nonreducing conditions (i.e., DTT and β-mercaptoethanol were omitted, respectively) to preserve
eventual disulfides.
这样的意思到底是要不要加热作 denature 呢？
如要，加热就不会打断双硫键破坏 dimer 吗？
恳请能人前被指教，感激不尽 <(_ _)>
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.117.39.44
1F：→ trumpet:non-reducing也是要加热让反应完全些，只是不含DTT or 2ME 04/12 14:59
2F：→ jsi:我最近也在跑non-reducing gel,使用不含DTT或2ME的loading dye 04/12 23:15
3F：→ jsi:sample不加热，gel配置没有改变，可侦测到dimer 04/12 23:16
4F：→ jsi:抱歉~是non-reducing condition不是non-reducing gel... 04/12 23:19
5F：→ FUJI0904:那请问在抽蛋白时，有些buffer会含 1~2 mM 的 DTT (可能 04/12 23:30
6F：→ FUJI0904:是当作保护吧...这部份的DTT也不要加吗？ 还是其实影响 04/12 23:31
7F：→ FUJI0904:不大呢？ 感谢j大 04/12 23:32
9F：→ jsi:避免使用DTT，但有时候理论跟实际也不一定相符XD 试了就知道 04/12 23:49
10F：→ FUJI0904:所以j大抽蛋白时有添加 DTT 或 B-Me 吗? 04/13 00:17
11F：→ jsi:没有添加DTT or B-Me 04/14 01:20