作者FUJI0904 (FUJI0904)
看板Biotech
標題[方法] 關於Caspase3和PARP的Western以及細胞週期相關問題
時間Mon Apr 11 12:09:17 2011
各位先進，小的有個問題想請教
最近剛做完藥物MTT的實驗，接著要轉到看Cell cycle的部分
老闆的意思是，如果SubG1有明顯增加的現象，就要看藥物是否引起
Mitochondrial apoptosis，所以接著要看 Caspase3 或 PARP 的活化與否
在MTT中可以很明顯的在 24 h treat 後看到 cell viability 下降
而在cell cycle上禮拜跑的結果卻發現相較 control組，SubG1 並沒有明顯增加
反而有 arrest 在 S phase 的情形，有同學在做 cell cycle 的跟我說，讓我延長作用
時間
因為如果可以發生 arrest，之後有可能就走進 apoptosis，這件事是對的嗎？
之所以不染 Annexin V 只是因為老闆覺得太貴，之前學長用完就不想再買了>"<
另外，由於之後可能要做 caspase3 和 PARP 的 WB
所以我問了學長姐，結果得到這兩個 protein 都不好染
尤其是在 whole cell lysate 的狀況下，由於表現量本就不高，不是很好做
讓我有點心慌，我就稍微去查了一下，發現壓得很好的 data 沒有提細節
有提細節做法的其實 data 也不清楚
我有看到有人的論文提及他們在做 WB 時會每個 well loading 30~50 ug 的
whole cell lysate，跟一般一個 well 不會超過 20 ug有點不同，不知是否為了解決表現
量比較少的問題？
有沒有人有相關經驗可以指點迷津的？
我學長是有說 PARP 可以直接抽核蛋白，增加每單位體積中 PARP 濃度...
但caspase3就不知該怎麼辦了...
懇請指引我一盞明燈吧!!!!
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◆ From: 140.117.39.44
1F：→ celestial318:caspase-3我記得不難壓欸...雖然很久以前的事= = 04/11 13:45
2F：推 im9527tw:caspase 3跟PARP都不難壓,我也都是whole cell lysate 04/11 13:54
3F：→ im9527tw:well loading 20~40ug,表現量都很多 04/11 13:55
4F：推 kakaman:兩者皆可用whole cell lysate 04/11 19:00
5F：→ FUJI0904:謝謝樓上諸位的見解^^，我想再問一下，我知道 04/11 19:22
6F：→ FUJI0904:pro-caspase3還算好看，但因老師不喜歡以pro的減少當作 04/11 19:22
7F：→ FUJI0904:活化，還是希望看到cleavaged form，請教這兩種蛋白的 04/11 19:23
8F：→ FUJI0904:cleavaged form也會跟pro一樣明顯嗎? 04/11 19:24
9F：推 kakaman:cell signaling的cleaved caspase-3很好壓 04/11 20:20
10F：推 celestial318:嗯...以前用IMGENEX的casp-3 pro跟cleaved都有 04/11 21:56
11F：→ FUJI0904:感謝大家^^，我們實驗室的好像是cell signaling的 04/12 03:02
12F：→ FUJI0904:不知道能不能請教一下kaka大的條件呢? 04/12 03:03
13F：→ FUJI0904:因昨天同學去壓，用我們實驗室的條件，cleavaged form 04/12 03:03
14F：→ FUJI0904:非常不明顯...學長非常認同這樣的結果...囧rz 04/12 03:04
15F：→ FUJI0904:我們是loading 20 ug 的 whole cell lysate 04/12 03:05
16F：→ FUJI0904:感謝kaka大 04/12 03:05
17F：推 im9527tw:我們家是用ZYMED的抗體,壓出來的Cl-casp 3也很明顯 04/12 11:33
18F：推 celestial318:loading多一點或抗體濃一點試試看XD 04/12 13:10
19F：→ tincta:我之前也是用cell signaling，同樣pro-明顯.cleaved不明顯 04/12 20:46
20F：→ tincta:據前輩說法，可以試試看從膜中間橫切，分開1抗，會有幫助 04/12 20:51
21F：→ FUJI0904:t大的意思是把pro和cleavaged剪開 04/12 21:57
22F：→ FUJI0904:然後壓同樣的抗體嗎？ 也謝謝kaka大的回信^^ 04/12 21:58
23F：→ FUJI0904:我都會試試 04/12 21:58
24F：→ kentingabc:目前也在跑，跑了好多次背景都很高(很髒)，不抱希望的 05/03 23:26
25F：→ kentingabc:把膜放著，洗了三天，今天壓出背景超乾淨的Caspase3 05/03 23:27