作者FUJI0904 (FUJI0904)
看板Biotech
标题[方法] 关於Caspase3和PARP的Western以及细胞周期相关问题
时间Mon Apr 11 12:09:17 2011
各位先进，小的有个问题想请教
最近刚做完药物MTT的实验，接着要转到看Cell cycle的部分
老板的意思是，如果SubG1有明显增加的现象，就要看药物是否引起
Mitochondrial apoptosis，所以接着要看 Caspase3 或 PARP 的活化与否
在MTT中可以很明显的在 24 h treat 後看到 cell viability 下降
而在cell cycle上礼拜跑的结果却发现相较 control组，SubG1 并没有明显增加
反而有 arrest 在 S phase 的情形，有同学在做 cell cycle 的跟我说，让我延长作用
时间
因为如果可以发生 arrest，之後有可能就走进 apoptosis，这件事是对的吗？
之所以不染 Annexin V 只是因为老板觉得太贵，之前学长用完就不想再买了>"<
另外，由於之後可能要做 caspase3 和 PARP 的 WB
所以我问了学长姐，结果得到这两个 protein 都不好染
尤其是在 whole cell lysate 的状况下，由於表现量本就不高，不是很好做
让我有点心慌，我就稍微去查了一下，发现压得很好的 data 没有提细节
有提细节做法的其实 data 也不清楚
我有看到有人的论文提及他们在做 WB 时会每个 well loading 30~50 ug 的
whole cell lysate，跟一般一个 well 不会超过 20 ug有点不同，不知是否为了解决表现
量比较少的问题？
有没有人有相关经验可以指点迷津的？
我学长是有说 PARP 可以直接抽核蛋白，增加每单位体积中 PARP 浓度...
但caspase3就不知该怎麽办了...
恳请指引我一盏明灯吧!!!!
--
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◆ From: 140.117.39.44
1F：→ celestial318:caspase-3我记得不难压欸...虽然很久以前的事= = 04/11 13:45
2F：推 im9527tw:caspase 3跟PARP都不难压,我也都是whole cell lysate 04/11 13:54
3F：→ im9527tw:well loading 20~40ug,表现量都很多 04/11 13:55
4F：推 kakaman:两者皆可用whole cell lysate 04/11 19:00
5F：→ FUJI0904:谢谢楼上诸位的见解^^，我想再问一下，我知道 04/11 19:22
6F：→ FUJI0904:pro-caspase3还算好看，但因老师不喜欢以pro的减少当作 04/11 19:22
7F：→ FUJI0904:活化，还是希望看到cleavaged form，请教这两种蛋白的 04/11 19:23
8F：→ FUJI0904:cleavaged form也会跟pro一样明显吗? 04/11 19:24
9F：推 kakaman:cell signaling的cleaved caspase-3很好压 04/11 20:20
10F：推 celestial318:嗯...以前用IMGENEX的casp-3 pro跟cleaved都有 04/11 21:56
11F：→ FUJI0904:感谢大家^^，我们实验室的好像是cell signaling的 04/12 03:02
12F：→ FUJI0904:不知道能不能请教一下kaka大的条件呢? 04/12 03:03
13F：→ FUJI0904:因昨天同学去压，用我们实验室的条件，cleavaged form 04/12 03:03
14F：→ FUJI0904:非常不明显...学长非常认同这样的结果...囧rz 04/12 03:04
15F：→ FUJI0904:我们是loading 20 ug 的 whole cell lysate 04/12 03:05
16F：→ FUJI0904:感谢kaka大 04/12 03:05
17F：推 im9527tw:我们家是用ZYMED的抗体,压出来的Cl-casp 3也很明显 04/12 11:33
18F：推 celestial318:loading多一点或抗体浓一点试试看XD 04/12 13:10
19F：→ tincta:我之前也是用cell signaling，同样pro-明显.cleaved不明显 04/12 20:46
20F：→ tincta:据前辈说法，可以试试看从膜中间横切，分开1抗，会有帮助 04/12 20:51
21F：→ FUJI0904:t大的意思是把pro和cleavaged剪开 04/12 21:57
22F：→ FUJI0904:然後压同样的抗体吗？ 也谢谢kaka大的回信^^ 04/12 21:58
23F：→ FUJI0904:我都会试试 04/12 21:58
24F：→ kentingabc:目前也在跑，跑了好多次背景都很高(很脏)，不抱希望的 05/03 23:26
25F：→ kentingabc:把膜放着，洗了三天，今天压出背景超乾净的Caspase3 05/03 23:27