作者wenwentien (期待雨後的彩虹)
看板Biotech
標題[求救] Ligation一直失敗~
時間Sat Apr 9 18:33:39 2011
大家好,目前在進行ligation碰到了問題,
請大家幫幫忙
我目前要接的insert約1.6k,而vector是8.4k左右
insert是先用PCR放大(在primer各加BamHl以及Xhol的切位), 接TA clone,
TA clone sequence結果正確, insert與多加的限制?切位也都有,
之後將insert與vector加入BamH1與Xhol切, 37度, 2.5~3小時~
跑膠結果大小都正確~
經過gel elute之後insert濃度約94ng/micro liter
而vector濃度約18ng/micro liter
V:I condition= 1:5, 因此ligation體積是V:I=1 microliter:5 microliter,
total volume是10 microliter, ligation buffer是10X的,
Ligation用兩種方式進行:
在16度裡overnight(a)與4度overnight(b)
transform也用兩種方式:
放冰上15min直接塗盤(c)
塗盤之前加入SOC medium, 37度, 1hr後塗盤(d)
因此有a-c,a-d,b-c, b-d四個plate, 但今天結果是一個colony都沒長~
想請教各專家, 我會是在哪個步驟出問題呢?
謝謝各位專家~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.39.99.16
1F：推 yaliu:ligation如果沒問題的話，可能是轉形～size有點大可能不好送 04/09 19:01
2F：推 milkpa:沒有做heat-shock?comptent cell有做positive control嗎? 04/09 20:56
3F：→ wenwentien:雖然一開始很懷疑,但我還是先按照產品說明書 04/09 21:43
4F：→ wenwentien:不做heat shock,但我應該要同時做positive control的 04/09 21:44
5F：→ wenwentien:謝謝milkpa專家的提醒~ 04/09 21:45
6F：推 littlebrs:我現在也是做ligation一直失敗:(( 04/13 08:27
7F：→ littlebrs:想順便問問大家 在ligation前都用機器直接測DNA濃度嗎? 04/13 08:29
8F：→ littlebrs:我是用跑膠去測vector和insert的亮度比 04/13 08:30
9F：推 yaliu:我比較懶，我憑感覺...insert給爆多，vector一點點 04/13 12:36
10F：→ yaliu:不過我insert大都比vector短 04/13 12:37
11F：推 tjbulls:insert都給比vector還要很多的量 大約1比5至6左右 04/19 03:44