作者wenwentien (期待雨後的彩虹)
看板Biotech
标题[求救] Ligation一直失败~
时间Sat Apr 9 18:33:39 2011
大家好,目前在进行ligation碰到了问题,
请大家帮帮忙
我目前要接的insert约1.6k,而vector是8.4k左右
insert是先用PCR放大(在primer各加BamHl以及Xhol的切位), 接TA clone,
TA clone sequence结果正确, insert与多加的限制?切位也都有,
之後将insert与vector加入BamH1与Xhol切, 37度, 2.5~3小时~
跑胶结果大小都正确~
经过gel elute之後insert浓度约94ng/micro liter
而vector浓度约18ng/micro liter
V:I condition= 1:5, 因此ligation体积是V:I=1 microliter:5 microliter,
total volume是10 microliter, ligation buffer是10X的,
Ligation用两种方式进行:
在16度里overnight(a)与4度overnight(b)
transform也用两种方式:
放冰上15min直接涂盘(c)
涂盘之前加入SOC medium, 37度, 1hr後涂盘(d)
因此有a-c,a-d,b-c, b-d四个plate, 但今天结果是一个colony都没长~
想请教各专家, 我会是在哪个步骤出问题呢?
谢谢各位专家~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.39.99.16
1F：推 yaliu:ligation如果没问题的话，可能是转形～size有点大可能不好送 04/09 19:01
2F：推 milkpa:没有做heat-shock?comptent cell有做positive control吗? 04/09 20:56
3F：→ wenwentien:虽然一开始很怀疑,但我还是先按照产品说明书 04/09 21:43
4F：→ wenwentien:不做heat shock,但我应该要同时做positive control的 04/09 21:44
5F：→ wenwentien:谢谢milkpa专家的提醒~ 04/09 21:45
6F：推 littlebrs:我现在也是做ligation一直失败:(( 04/13 08:27
7F：→ littlebrs:想顺便问问大家 在ligation前都用机器直接测DNA浓度吗? 04/13 08:29
8F：→ littlebrs:我是用跑胶去测vector和insert的亮度比 04/13 08:30
9F：推 yaliu:我比较懒，我凭感觉...insert给爆多，vector一点点 04/13 12:36
10F：→ yaliu:不过我insert大都比vector短 04/13 12:37
11F：推 tjbulls:insert都给比vector还要很多的量 大约1比5至6左右 04/19 03:44