要搞懂還是弄一套 molecular cloning 來看看比較好 ※ 引述《Johnpolo (隱行)》之銘言： : 想請問一下 我現在抽完RNA 然後是不是要轉cDNA才能ligation : 那是要用什麼方法 是用一般PCR 還是RT-PCR RT-PCR 平常是指 real time 吧？ 你說的狀況 是要先用 reverse transcriptase （配 poly-T primer）反應一次 製造出單股 DNA 然後拿去跑普通的 PCR : 然後PCR後的雙股DNA不是 線性的嗎? 然後要怎麼Ligation 對 ligate 到 plasmid : 假如是ligation到質體 是不是要先用限制脢切 看你用哪種 cloning 方法 基本的方法就是在你 PCR 的階段, primer 就設計有切位 PCR 出來拿去切 然後接進也是切過的 plasmid 但是你也可以用 TA cloning: TA cloning 用的 plasmid 你拿特定的限制脢去切會兩頭都切出一個 t overhang （也可以直接買切好的） 而 PCR 產物 如果你的 polymerase 用的是不會 proofreading 的（比方說Taq） PCR 出來兩端其實都會有一個 a overhange 所以這樣的 PCR 產物就可以直接接進去 不用先切 當然 方向要靠運氣而且 TA vector 很多都不是 expression vector, 所以還要再 clone 到你真正想要的 plasmid 裡 但是手上先拿到 target gene 的 TA construct 安心很多 XD : 可是聽別人說只要heat shock就可以 我現在很不懂 heat shock 是 transform 時的步驟了吧 如果你是說 PCR 產物直接拿去餵給 E coli, heat shock 一下就可以進去 我就沒有聽過類似的技術了 --

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