要搞懂还是弄一套 molecular cloning 来看看比较好 ※ 引述《Johnpolo (隐行)》之铭言： : 想请问一下 我现在抽完RNA 然後是不是要转cDNA才能ligation : 那是要用什麽方法 是用一般PCR 还是RT-PCR RT-PCR 平常是指 real time 吧？ 你说的状况 是要先用 reverse transcriptase （配 poly-T primer）反应一次 制造出单股 DNA 然後拿去跑普通的 PCR : 然後PCR後的双股DNA不是 线性的吗? 然後要怎麽Ligation 对 ligate 到 plasmid : 假如是ligation到质体 是不是要先用限制脢切 看你用哪种 cloning 方法 基本的方法就是在你 PCR 的阶段, primer 就设计有切位 PCR 出来拿去切 然後接进也是切过的 plasmid 但是你也可以用 TA cloning: TA cloning 用的 plasmid 你拿特定的限制脢去切会两头都切出一个 t overhang （也可以直接买切好的） 而 PCR 产物 如果你的 polymerase 用的是不会 proofreading 的（比方说Taq） PCR 出来两端其实都会有一个 a overhange 所以这样的 PCR 产物就可以直接接进去 不用先切 当然 方向要靠运气而且 TA vector 很多都不是 expression vector, 所以还要再 clone 到你真正想要的 plasmid 里 但是手上先拿到 target gene 的 TA construct 安心很多 XD : 可是听别人说只要heat shock就可以 我现在很不懂 heat shock 是 transform 时的步骤了吧 如果你是说 PCR 产物直接拿去喂给 E coli, heat shock 一下就可以进去 我就没有听过类似的技术了 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 131.212.221.169