作者penguinanny (ayumiann~*)
看板Biotech
標題[求救] p53磷酸化的結果不一致
時間Fri Apr 1 00:37:40 2011
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
----請將上列注意事項以
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大家好~(*^v^*)
最近我開始接觸細胞實驗
所以剛開始 學姊是希望可以重複他的結果
但是阿 我怎麼做結果都跟學姊的相反...(= =)
討論也找不到原因,因此希望可以有人可以幫幫忙~~~
實驗目的是有兩株細胞(A和B)
然後利用UV(或是HU)造成damage後,看p53磷酸化的表現
學姊的結果都是A比B高,但是我怎麼做都是B比A高
以下為實驗過程,不知道哪裡比較有可能發生問題~
(因為最近才第一次接觸這個 所以很怕有明顯錯誤自己卻不知道...)
1.於6mm dish種5x10五次方的細胞於隔天
(細胞數會太多嗎???太多的話是不是會影響實驗結果勒???)
2.將貼附好的細胞的medium吸乾,照UV(100 J/m2)
照完加入medium培養不同時間點
3.於不同時間點將細胞medium吸乾,用冰的PBS洗一次,
加入lysis buffer把細胞刮下來,冰-80度西到隔天
4.離心取上清液定量
以上就是我處理細胞的過程,不知道有沒有哪裡做的不好還是做錯的部分
謝謝大家 歡迎糾正~~~>"<
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.36.0.199
1F：推 owl628:我也有類似情況,不過我是用MEF,然後用doxorubicin處理造成 04/01 12:22
2F：→ owl628:DNA double strand break,然後看rH2AX的表現,重點每次結果 04/01 12:23
3F：→ owl628:都不一致,完全不知道為啥????? 04/01 12:23
4F：推 celestial318:下次請學姐看你做...盡量步驟一致 04/01 21:23
5F：→ blence:拿你學姊A跟B某個時間點的actin,確認是否是control量的差異 04/01 22:17
6F：→ penguinanny:學姊很忙 没有時間看著我做 不過有盡量問學姊每個步驟 04/01 22:22
7F：→ penguinanny:請問blence我有點不懂你的意思耶~ 04/01 22:23
8F：→ penguinanny:可以麻煩在說一次嗎???拜託~謝謝~>"< 04/01 22:24
9F：推 celestial318:確認兩株細胞內protein的basal level 04/01 22:33
10F：推 owl628:我好奇問一下,假如他學姊拿30ug去跑,原po拿40ug去跑,這樣會 04/01 22:44
11F：→ owl628:導致他們結果完全相反嗎????? 04/01 22:44
12F：推 owl628:原PO學姊A跟B拿30,原PO的A跟B拿40跑,這樣會有這麼大差異??? 04/01 22:47
13F：→ blence:學姊的30ug是真的30ug,但原po定量的40ug是20ug,這樣不會嗎? 04/01 22:49
14F：推 owl628:原PO應該有跑internal control吧,所以有差異應該會知道 04/01 23:07
15F：推 sjacky:建議你拿學姐的蛋白定量,跑WB,看b-actin&p-p58結果是否與學 04/02 21:59
16F：→ sjacky:姐相同 3 04/02 21:59