作者shenhsu (軒)
看板Biotech
標題[求救] real-time PCR結果分析上的疑惑
時間Thu Mar 24 23:59:41 2011
主要是對於結果分析上有些疑惑想請問版上的大大
由於real-time PCR做出來的結果是相對表現量
那如果有一基因應該不表現卻還是做的出結果該如何解釋才好？
我的實驗設計是這樣的:
我將A物種的target gene overexpression在另一B物種後
想觀察overexpression是否影響B物種中其他gene表現
這時用real-time PCR分析發現2個問題
1.target gene確實overexpression
且由於B物種wild type應該完全不表現target gene
故overexpression量非常之高 是wild type的好幾百倍
但若能算出倍數 表示wild type勢必仍有一極低值被偵測到
事後run gel也確實出現正確大小的band (total 40 cycle, Ct值約30左右)
那麼這種因為高cycle數才做出的結果
邏輯上似乎又說不太過去 (因為應該完全不表現)
2.另外其他gene表現量"皆"觀察到有降低40%左右的變化
但這些gene在wild type中的表現量相對於我的target gene卻只有2-3倍
也就是說對於一個應該完全不表現的基因才比它高2-3倍
那這些基因不就幾乎可以說是其實也沒有表現????
那麼對於沒有表現的基因降低40%根本就是沒有差異???
是這樣說的嗎????
總覺得是有些邏輯上的問題想不通~"~
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◆ From: 140.115.48.144
1F：推 rpr:針對第一點，會不會是你amplify到genomic DNA了呢? 03/25 00:44
2F：推 mattmatt:嚴格點的話你需要分析顯著性.才能下結論 03/25 00:53
3F：→ mattmatt:但第一點有可能是genomic DNA殘留或是basal level表現量 03/25 00:54
4F：→ mattmatt:你的基因有好幾百倍的話一定有顯著性 03/25 00:54
5F：→ mattmatt:第二點不曉得你的40%是相對表現量? 絕對量? Ct值? 03/25 00:55
6F：→ mattmatt:但如果表現量真的只有兩三倍的差異真的就不太顯著 03/25 00:57
7F：→ mattmatt:你也需該考慮sample的處理上是否真的造成顯著差異 03/25 00:58
8F：→ mattmatt:另外 其實很難說一個基因"完全"不表現 也許只是很低 03/25 00:59
9F：→ mattmatt:所以才會另外找internal control來做標準化並比較 03/25 01:00
10F：推 verdure:Ct值30有點太高了吧! 03/25 12:11