作者shenhsu (轩)
看板Biotech
标题[求救] real-time PCR结果分析上的疑惑
时间Thu Mar 24 23:59:41 2011
主要是对於结果分析上有些疑惑想请问版上的大大
由於real-time PCR做出来的结果是相对表现量
那如果有一基因应该不表现却还是做的出结果该如何解释才好？
我的实验设计是这样的:
我将A物种的target gene overexpression在另一B物种後
想观察overexpression是否影响B物种中其他gene表现
这时用real-time PCR分析发现2个问题
1.target gene确实overexpression
且由於B物种wild type应该完全不表现target gene
故overexpression量非常之高 是wild type的好几百倍
但若能算出倍数 表示wild type势必仍有一极低值被侦测到
事後run gel也确实出现正确大小的band (total 40 cycle, Ct值约30左右)
那麽这种因为高cycle数才做出的结果
逻辑上似乎又说不太过去 (因为应该完全不表现)
2.另外其他gene表现量"皆"观察到有降低40%左右的变化
但这些gene在wild type中的表现量相对於我的target gene却只有2-3倍
也就是说对於一个应该完全不表现的基因才比它高2-3倍
那这些基因不就几乎可以说是其实也没有表现????
那麽对於没有表现的基因降低40%根本就是没有差异???
是这样说的吗????
总觉得是有些逻辑上的问题想不通~"~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.48.144
1F：推 rpr:针对第一点，会不会是你amplify到genomic DNA了呢? 03/25 00:44
2F：推 mattmatt:严格点的话你需要分析显着性.才能下结论 03/25 00:53
3F：→ mattmatt:但第一点有可能是genomic DNA残留或是basal level表现量 03/25 00:54
4F：→ mattmatt:你的基因有好几百倍的话一定有显着性 03/25 00:54
5F：→ mattmatt:第二点不晓得你的40%是相对表现量? 绝对量? Ct值? 03/25 00:55
6F：→ mattmatt:但如果表现量真的只有两三倍的差异真的就不太显着 03/25 00:57
7F：→ mattmatt:你也需该考虑sample的处理上是否真的造成显着差异 03/25 00:58
8F：→ mattmatt:另外 其实很难说一个基因"完全"不表现 也许只是很低 03/25 00:59
9F：→ mattmatt:所以才会另外找internal control来做标准化并比较 03/25 01:00
10F：推 verdure:Ct值30有点太高了吧! 03/25 12:11