※ 引述《hchung (hiflypig)》之銘言： : ※ 引述《alicialai (Fairy Monster)》之銘言： : : Hey there, 抱歉回晚了, : : 嘛~~~ 首先~~ 我不是A大, 我只是個在science中載浮載沉的小學生XDDD~ : : 1. after pronase處理之後就上blocking囉, 沒有再煮了~~ : : 2. Acetone這個方法我沒有試過捏, 但那個比較像是硬骨切片的處理方式(樹酯包埋), : : 而且我有點doubt那是antigen retrival嗎? : : 因為anitgen retrival的原理是將在脫臘包埋時, : : 因為浸入有機溶劑或因為石蠟高溫而失活或是被蓋住的antigen呈現出來, : : 所以才會用enzyme(trypsin, pepsin, protease or pronase), : : 或是煮(citrate buffer)的方式, 但acetone似乎沒有類似的功能, : : 而且您說是combine H2O2, 這比較像是去endogenous peroxidase的步驟喔. : : (若有錯誤請指正, 感謝喔^___^) : : 我那時候是染骨組織中的內皮細胞, 也就是血管的部分, : : Pronase我染出來非常明顯, 但我前一篇也說囉, : : it depends on your antigen, : : 那時候我同事用我的方法去染軟管(type II or type X collagen)就沒用. : : 3. commercial的脫鈣液, 呃~~~ 不會是含fomic acid的吧, 如果是, 那就有問題了, : : 能請問您一次脫鈣大約多久? 有大部分的抗體是只能用EDTA脫鈣的喔, Fomic acid會 : : 破壞antigen, 所以大部分IHC只傾向用EDTA脫鈣, 但壞處就是EDTA脫鈣很耗時間~ : : 希望有幫到您的忙, 有問題的話在互相討論囉^___^~ : 終於等到你上線了.......^^ : 1.那可以問你買的 pronase的廠商以及貨號嗎？我查了sigma 跟辜狗大神有發現幾 : 家，但是我還是不知道要買哪家的？ : 不過要在買之前，還是要先問你怎麼查到底適不適合我的抗體呢？BTW我要染的是 : 骨頭上面的細胞，Osteocalcin 跟cathepsin k。 hmmmmmmmm... 這個有點抱歉捏~~~ 因為是兩年前的事情了~~ 我已經忘掉貨號了, 但是依稀記得是sigma的沒錯.. 另外, 抗體的data sheet會有recommand的retrival方式, antigen的話, 我只能說, 一個一個試吧, 我那時候也是一個一個試, 不過~~~ 你可以問問看賣你抗體的sales, 有沒有別間實驗室有買, 打聽一下有染出來的實驗室是用甚麼方式..XDD 這兩個protein我只有做過WB, 沒有染過IHC說, 抱歉可能無法幫你的忙~~@@ : 2.我發現我講錯了>''<，那篇paper是用methanol加上H2O2(paper寫的，for antigen : retrieval )，不過染出來就是非常淡...幾乎看不見，不過很神奇的是那篇paper : 的圖還可以看到細胞就是了>_<。 用Methanol還寫for antigen retrival就更奇怪了, 這明明是H2O2的配法啊~~ 能偷偷問是哪一本journal嗎??? Beside, 有一些IHC是不做retrival的步驟的~~ : 3.另外呢~我的脫鈣液是買日本試藥的decalcifier(rapid)，這個脫鈣非常快， : 一個禮拜就差不多了。但是他的藥品的詳細資料我查不太到，是病理科用的， : 我會再查查他的成分的，因為我目前用一種acid phosphatase leukocyte kit， : 完全沒有辦法染出來，讓我開始懷疑他的成分。大部分的paper是用EDTA脫鈣， : 所以我猜脫鈣液可能要再找找。 嘛~~~ 通常快速脫鈣液都是acid base喔~~ data sheet上是否有寫可應用於IHC? : 4.另外可以問你EDTA的泡法嗎？大概脫鈣多久？condition是如何？ : 我目前有看到有人用14% 10% 20%脫鈣時間則很少人寫， : pH有7.4或8的。 : 麻煩你了~ EDTA的泡法google一下應該找的到, 我用的是0.5M EDTA, ph8.0.. 時間嘛, 你是mice or rat? 用EDTA脫mice tibia or femur, 4度C下shaking, 每兩天或三天換一次EDTA, 約10天. rat用EDTA可能要脫3個月.. 是的, 三個月~~ in addition, 脫鈣也不能脫太久喔~~ marrow會流失.. PS. 一併回這好了, D道友用的膠帶法我也玩過(resin embedd calcified bone), 是真的很好用, 可惜很貴, 而且只有那種膠帶可用~~~~~ 囧rz~~ --

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