※ 引述《hchung (hiflypig)》之铭言： : ※ 引述《alicialai (Fairy Monster)》之铭言： : : Hey there, 抱歉回晚了, : : 嘛~~~ 首先~~ 我不是A大, 我只是个在science中载浮载沉的小学生XDDD~ : : 1. after pronase处理之後就上blocking罗, 没有再煮了~~ : : 2. Acetone这个方法我没有试过捏, 但那个比较像是硬骨切片的处理方式(树酯包埋), : : 而且我有点doubt那是antigen retrival吗? : : 因为anitgen retrival的原理是将在脱腊包埋时, : : 因为浸入有机溶剂或因为石蜡高温而失活或是被盖住的antigen呈现出来, : : 所以才会用enzyme(trypsin, pepsin, protease or pronase), : : 或是煮(citrate buffer)的方式, 但acetone似乎没有类似的功能, : : 而且您说是combine H2O2, 这比较像是去endogenous peroxidase的步骤喔. : : (若有错误请指正, 感谢喔^___^) : : 我那时候是染骨组织中的内皮细胞, 也就是血管的部分, : : Pronase我染出来非常明显, 但我前一篇也说罗, : : it depends on your antigen, : : 那时候我同事用我的方法去染软管(type II or type X collagen)就没用. : : 3. commercial的脱钙液, 呃~~~ 不会是含fomic acid的吧, 如果是, 那就有问题了, : : 能请问您一次脱钙大约多久? 有大部分的抗体是只能用EDTA脱钙的喔, Fomic acid会 : : 破坏antigen, 所以大部分IHC只倾向用EDTA脱钙, 但坏处就是EDTA脱钙很耗时间~ : : 希望有帮到您的忙, 有问题的话在互相讨论罗^___^~ : 终於等到你上线了.......^^ : 1.那可以问你买的 pronase的厂商以及货号吗？我查了sigma 跟辜狗大神有发现几 : 家，但是我还是不知道要买哪家的？ : 不过要在买之前，还是要先问你怎麽查到底适不适合我的抗体呢？BTW我要染的是 : 骨头上面的细胞，Osteocalcin 跟cathepsin k。 hmmmmmmmm... 这个有点抱歉捏~~~ 因为是两年前的事情了~~ 我已经忘掉货号了, 但是依稀记得是sigma的没错.. 另外, 抗体的data sheet会有recommand的retrival方式, antigen的话, 我只能说, 一个一个试吧, 我那时候也是一个一个试, 不过~~~ 你可以问问看卖你抗体的sales, 有没有别间实验室有买, 打听一下有染出来的实验室是用甚麽方式..XDD 这两个protein我只有做过WB, 没有染过IHC说, 抱歉可能无法帮你的忙~~@@ : 2.我发现我讲错了>''<，那篇paper是用methanol加上H2O2(paper写的，for antigen : retrieval )，不过染出来就是非常淡...几乎看不见，不过很神奇的是那篇paper : 的图还可以看到细胞就是了>_<。 用Methanol还写for antigen retrival就更奇怪了, 这明明是H2O2的配法啊~~ 能偷偷问是哪一本journal吗??? Beside, 有一些IHC是不做retrival的步骤的~~ : 3.另外呢~我的脱钙液是买日本试药的decalcifier(rapid)，这个脱钙非常快， : 一个礼拜就差不多了。但是他的药品的详细资料我查不太到，是病理科用的， : 我会再查查他的成分的，因为我目前用一种acid phosphatase leukocyte kit， : 完全没有办法染出来，让我开始怀疑他的成分。大部分的paper是用EDTA脱钙， : 所以我猜脱钙液可能要再找找。 嘛~~~ 通常快速脱钙液都是acid base喔~~ data sheet上是否有写可应用於IHC? : 4.另外可以问你EDTA的泡法吗？大概脱钙多久？condition是如何？ : 我目前有看到有人用14% 10% 20%脱钙时间则很少人写， : pH有7.4或8的。 : 麻烦你了~ EDTA的泡法google一下应该找的到, 我用的是0.5M EDTA, ph8.0.. 时间嘛, 你是mice or rat? 用EDTA脱mice tibia or femur, 4度C下shaking, 每两天或三天换一次EDTA, 约10天. rat用EDTA可能要脱3个月.. 是的, 三个月~~ in addition, 脱钙也不能脱太久喔~~ marrow会流失.. PS. 一并回这好了, D道友用的胶带法我也玩过(resin embedd calcified bone), 是真的很好用, 可惜很贵, 而且只有那种胶带可用~~~~~ 囧rz~~ --

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