作者zephyrhex (zephyr)
看板Biotech
標題[求救] protein表現很差啊啊啊啊啊~~~~
時間Sun Mar 13 18:27:23 2011
各位前輩們好
小弟我卡在一個部份卡了兩個多月了orz
就是在表現我的protein上一直達不到要求的量
這個題目我是第三個接手的人
之前的學長姐已經把各種條件都試得差不多了(包括host)
protein接在pGEX-4T-1帶有GST tag 送進BL21(DE)表現
主要在37度culture，OD 0.5~0.6+1 mM IPTG+28度induction<---這是小量表現
由於我們的目的要得到大量純化protein去養晶 要有mg等級的量
所以會用到fermentor去養 condition除了會改成增菌到OD 18~20左右外都跟上述一樣
看之前學長姊留下的紀錄也都養得很OK....
純化出來該有的peak range都有達到...
But!
小弟我照這方法去養fermentor表現量就是奇差無比
還想會不會是發酵槽條件太好 又把誘導溫度調低到16度再調低轉速 結果更糟 囧!
之前學長姐的問題是無法克服protein在純化過程大量degrade的問題
(所以這個題目才會經過兩個人了還沒做出來.....)
我目前是找到比較好的方法可以讓degrade的問題降到最低
卻反而一直表現不出來....真的超悶
我現在都開始懷疑起之前學姊留給我的plasmid是不是怪怪的= =.....
有沒有前輩能提供小弟一點意見呢? 感激不盡
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.52.23
1F：推 milkpa:找clp deletion的host，就是protease mutant 03/13 22:35
2F：推 licat:把質體重新送進BL21 再作小量誘導 看有沒有大量表現 03/14 10:56
3F：→ licat:有的話再放大作 （你目前手上的菌可能已經突變了） 03/14 10:57
4F：→ arohaii:降低溫度又調低轉速 一次改變兩個變因 請問你要怎麼分析? 03/21 21:20
5F：→ arohaii:你太心急! 把條件列出來 一條一條慢慢分析 慢慢改 03/21 21:22
6F：→ arohaii:發酵槽困難在於結合物理、化學、生物 你更應該要多思考 03/21 21:23
7F：→ arohaii:我也有三 四個月做不出來經驗 只因為轉速不夠 03/21 21:24
8F：→ arohaii:但是發現當下很開心 因為過程我學到更多 03/21 21:25
9F：→ arohaii:當科學家就是要獨立解決問題 自己才是最清楚狀況的人 03/21 21:28
10F：→ arohaii:發酵槽要有耐心 實驗時間長 所以更要把每次實驗當最後一次 03/21 21:30
11F：→ arohaii:心急只會亂做實驗 加速你的失敗.. 03/21 21:32