作者zephyrhex (zephyr)
看板Biotech
标题[求救] protein表现很差啊啊啊啊啊~~~~
时间Sun Mar 13 18:27:23 2011
各位前辈们好
小弟我卡在一个部份卡了两个多月了orz
就是在表现我的protein上一直达不到要求的量
这个题目我是第三个接手的人
之前的学长姐已经把各种条件都试得差不多了(包括host)
protein接在pGEX-4T-1带有GST tag 送进BL21(DE)表现
主要在37度culture，OD 0.5~0.6+1 mM IPTG+28度induction<---这是小量表现
由於我们的目的要得到大量纯化protein去养晶 要有mg等级的量
所以会用到fermentor去养 condition除了会改成增菌到OD 18~20左右外都跟上述一样
看之前学长姊留下的纪录也都养得很OK....
纯化出来该有的peak range都有达到...
But!
小弟我照这方法去养fermentor表现量就是奇差无比
还想会不会是发酵槽条件太好 又把诱导温度调低到16度再调低转速 结果更糟 囧!
之前学长姐的问题是无法克服protein在纯化过程大量degrade的问题
(所以这个题目才会经过两个人了还没做出来.....)
我目前是找到比较好的方法可以让degrade的问题降到最低
却反而一直表现不出来....真的超闷
我现在都开始怀疑起之前学姊留给我的plasmid是不是怪怪的= =.....
有没有前辈能提供小弟一点意见呢? 感激不尽
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.52.23
1F：推 milkpa:找clp deletion的host，就是protease mutant 03/13 22:35
2F：推 licat:把质体重新送进BL21 再作小量诱导 看有没有大量表现 03/14 10:56
3F：→ licat:有的话再放大作 （你目前手上的菌可能已经突变了） 03/14 10:57
4F：→ arohaii:降低温度又调低转速 一次改变两个变因 请问你要怎麽分析? 03/21 21:20
5F：→ arohaii:你太心急! 把条件列出来 一条一条慢慢分析 慢慢改 03/21 21:22
6F：→ arohaii:发酵槽困难在於结合物理、化学、生物 你更应该要多思考 03/21 21:23
7F：→ arohaii:我也有三 四个月做不出来经验 只因为转速不够 03/21 21:24
8F：→ arohaii:但是发现当下很开心 因为过程我学到更多 03/21 21:25
9F：→ arohaii:当科学家就是要独立解决问题 自己才是最清楚状况的人 03/21 21:28
10F：→ arohaii:发酵槽要有耐心 实验时间长 所以更要把每次实验当最後一次 03/21 21:30
11F：→ arohaii:心急只会乱做实验 加速你的失败.. 03/21 21:32