※ 引述《alicialai (Fairy Monster)》之銘言： : ※ 引述《hchung (hiflypig)》之銘言： : : 那我可以再問細節一點的問題嗎? : : 1.你用1mg/ml pronase處理過 還需要用煮的方法做antigne retrieval嗎? : : 2.我後來其實有用acetone加H2O2去做antigen retrieval (某篇paper寫的) : : 然而我很懷疑這樣真的能夠retrieval~雖然我染出來感覺有點出來。 : : 但是真的好淡好淡 : : 想問A大用的方法染出來就會很明顯嗎? : : 3.另外就是我的脫鈣用的是commercial 的脫鈣液，並不是自己泡的EDTA， : : 不知道這樣會不會影響貼片呢?因為大部分的paper是寫EDTA脫鈣? : : 最後 很感謝A大~我以為這篇文章應該就會被埋沒起來了~結果又來了一道曙光 : : 希望這次真的能夠克服掉片問題~ : Hey there, 抱歉回晚了, : 嘛~~~ 首先~~ 我不是A大, 我只是個在science中載浮載沉的小學生XDDD~ : 1. after pronase處理之後就上blocking囉, 沒有再煮了~~ : 2. Acetone這個方法我沒有試過捏, 但那個比較像是硬骨切片的處理方式(樹酯包埋), : 而且我有點doubt那是antigen retrival嗎? : 因為anitgen retrival的原理是將在脫臘包埋時, : 因為浸入有機溶劑或因為石蠟高溫而失活或是被蓋住的antigen呈現出來, : 所以才會用enzyme(trypsin, pepsin, protease or pronase), : 或是煮(citrate buffer)的方式, 但acetone似乎沒有類似的功能, : 而且您說是combine H2O2, 這比較像是去endogenous peroxidase的步驟喔. : (若有錯誤請指正, 感謝喔^___^) : 我那時候是染骨組織中的內皮細胞, 也就是血管的部分, : Pronase我染出來非常明顯, 但我前一篇也說囉, : it depends on your antigen, : 那時候我同事用我的方法去染軟管(type II or type X collagen)就沒用. : 3. commercial的脫鈣液, 呃~~~ 不會是含fomic acid的吧, 如果是, 那就有問題了, : 能請問您一次脫鈣大約多久? 有大部分的抗體是只能用EDTA脫鈣的喔, Fomic acid會 : 破壞antigen, 所以大部分IHC只傾向用EDTA脫鈣, 但壞處就是EDTA脫鈣很耗時間~ : 希望有幫到您的忙, 有問題的話在互相討論囉^___^~ 終於等到你上線了.......^^ 1.那可以問你買的 pronase的廠商以及貨號嗎？我查了sigma 跟辜狗大神有發現幾 家，但是我還是不知道要買哪家的？ 不過要在買之前，還是要先問你怎麼查到底適不適合我的抗體呢？BTW我要染的是 骨頭上面的細胞，Osteocalcin 跟cathepsin k。 2.我發現我講錯了>''<，那篇paper是用methanol加上H2O2(paper寫的，for antigen retrieval )，不過染出來就是非常淡...幾乎看不見，不過很神奇的是那篇paper 的圖還可以看到細胞就是了>_<。 3.另外呢~我的脫鈣液是買日本試藥的decalcifier(rapid)，這個脫鈣非常快， 一個禮拜就差不多了。但是他的藥品的詳細資料我查不太到，是病理科用的， 我會再查查他的成分的，因為我目前用一種acid phosphatase leukocyte kit， 完全沒有辦法染出來，讓我開始懷疑他的成分。大部分的paper是用EDTA脫鈣， 所以我猜脫鈣液可能要再找找。 4.另外可以問你EDTA的泡法嗎？大概脫鈣多久？condition是如何？ 我目前有看到有人用14% 10% 20%脫鈣時間則很少人寫， pH有7.4或8的。 麻煩你了~ --

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