※ 引述《alicialai (Fairy Monster)》之铭言： : ※ 引述《hchung (hiflypig)》之铭言： : : 那我可以再问细节一点的问题吗? : : 1.你用1mg/ml pronase处理过 还需要用煮的方法做antigne retrieval吗? : : 2.我後来其实有用acetone加H2O2去做antigen retrieval (某篇paper写的) : : 然而我很怀疑这样真的能够retrieval~虽然我染出来感觉有点出来。 : : 但是真的好淡好淡 : : 想问A大用的方法染出来就会很明显吗? : : 3.另外就是我的脱钙用的是commercial 的脱钙液，并不是自己泡的EDTA， : : 不知道这样会不会影响贴片呢?因为大部分的paper是写EDTA脱钙? : : 最後 很感谢A大~我以为这篇文章应该就会被埋没起来了~结果又来了一道曙光 : : 希望这次真的能够克服掉片问题~ : Hey there, 抱歉回晚了, : 嘛~~~ 首先~~ 我不是A大, 我只是个在science中载浮载沉的小学生XDDD~ : 1. after pronase处理之後就上blocking罗, 没有再煮了~~ : 2. Acetone这个方法我没有试过捏, 但那个比较像是硬骨切片的处理方式(树酯包埋), : 而且我有点doubt那是antigen retrival吗? : 因为anitgen retrival的原理是将在脱腊包埋时, : 因为浸入有机溶剂或因为石蜡高温而失活或是被盖住的antigen呈现出来, : 所以才会用enzyme(trypsin, pepsin, protease or pronase), : 或是煮(citrate buffer)的方式, 但acetone似乎没有类似的功能, : 而且您说是combine H2O2, 这比较像是去endogenous peroxidase的步骤喔. : (若有错误请指正, 感谢喔^___^) : 我那时候是染骨组织中的内皮细胞, 也就是血管的部分, : Pronase我染出来非常明显, 但我前一篇也说罗, : it depends on your antigen, : 那时候我同事用我的方法去染软管(type II or type X collagen)就没用. : 3. commercial的脱钙液, 呃~~~ 不会是含fomic acid的吧, 如果是, 那就有问题了, : 能请问您一次脱钙大约多久? 有大部分的抗体是只能用EDTA脱钙的喔, Fomic acid会 : 破坏antigen, 所以大部分IHC只倾向用EDTA脱钙, 但坏处就是EDTA脱钙很耗时间~ : 希望有帮到您的忙, 有问题的话在互相讨论罗^___^~ 终於等到你上线了.......^^ 1.那可以问你买的 pronase的厂商以及货号吗？我查了sigma 跟辜狗大神有发现几 家，但是我还是不知道要买哪家的？ 不过要在买之前，还是要先问你怎麽查到底适不适合我的抗体呢？BTW我要染的是 骨头上面的细胞，Osteocalcin 跟cathepsin k。 2.我发现我讲错了>''<，那篇paper是用methanol加上H2O2(paper写的，for antigen retrieval )，不过染出来就是非常淡...几乎看不见，不过很神奇的是那篇paper 的图还可以看到细胞就是了>_<。 3.另外呢~我的脱钙液是买日本试药的decalcifier(rapid)，这个脱钙非常快， 一个礼拜就差不多了。但是他的药品的详细资料我查不太到，是病理科用的， 我会再查查他的成分的，因为我目前用一种acid phosphatase leukocyte kit， 完全没有办法染出来，让我开始怀疑他的成分。大部分的paper是用EDTA脱钙， 所以我猜脱钙液可能要再找找。 4.另外可以问你EDTA的泡法吗？大概脱钙多久？condition是如何？ 我目前有看到有人用14% 10% 20%脱钙时间则很少人写， pH有7.4或8的。 麻烦你了~ --

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