作者diffa2 (Zero)
看板Biotech
標題[求救] M15 competent cell protein induce
時間Tue Mar 8 14:00:10 2011
想請問是否有人使用過M15/[pREP4]來誘導protein的表現，目前在實驗上遇到一些問題
想請教大家。
在clone上，設計一組primer帶有BamHI cutting site 將基因的CDS (含有start codon
不含 stop codon)將其接入 pQE-60的BamHI site之後trnasformation到M15[pREP4]細菌
中表現。
plasmid的架構:
------------CC ATG GGA GGATCC ATG-------------------TAA----
vector上的 start codon BamHI CDS的start codon vector上的stop codon
transformation到M15/[pREP4] competent cell中塗盤到含有Kanamcyin(25μM) 及
Ampicillin(50μM)的LB plate，挑single colony到養菌管含有Kan(25μM) 和Amp(50μ
M)的3ml LB中，搖16小時候取500μl的菌液，以1:100的菌量放大加到含有Kan(25μM)和
Amp (50μM)的50ml的LB中，置37℃incubator 3 hr後用IPTG induce 3~4 hr (37℃)，最
後跑膠的結果都沒有induce出來。之後分別用了不同濃度的IPTG indce (0.005mM~100mM)
也都沒有induce出protein。
之後也將M15/[pREP4] competent cell分別劃菌在含有Kan(25μM ) 和Amp(50μM)的
plate中，在amp的LB-plate菌沒有長可是在Kan的LB-plate中有長，接著將Kan plate中的
single colony到含有Kan(25μM)的3ml LB中搖16小時抽菌的plasmid，pREP4 plasmid大
小3740 bp但我抽出來的plasmid supercoil form跑膠大小在9 Kb的位置，但在Kan plate
中會長colony但抽出的plasmid大小有不同，不知問題出在哪裡。
想請問是否有人有用M15/[pREP4]誘導過protein，請教各位了><”。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.48.76
1F：推 kenseifan:你IPTG用量好像有點低 03/08 20:37
2F：→ diffa2:我試過的濃度由最低0.005mM到最高100mM，在Qiagen protocol 03/08 23:54
3F：→ diffa2:是使用1mM,我試過0.005mM,0.01mM,0.05mM,0.1mM,0.5mM,1mM 03/09 00:03
4F：→ diffa2:10mM,50mM,100mM,跑protein膠出現的pattern都相同 03/09 00:07
5F：推 kenseifan:我之前的一個經驗是 M15長的非常快 所以INDUCTION的時間 03/09 09:56
6F：→ kenseifan:不能太長 要不然就是降低溫度 03/09 09:56
7F：→ diffa2:想再請問一下，induce後的protein會和induce前會有明顯的差 03/09 19:32
8F：→ diffa2:異嗎?是否可辨別出誘導後的protein有明顯的表現出來。 03/09 19:36
9F：→ diffa2:有試過室溫induce(約20度)5小時，可能時間太久跑膠後沒差異 03/09 19:40
10F：推 kenseifan:有阿 跑膠看的出來阿 你可以試試18度 03/10 09:51
11F：→ diffa2:嗯嗯~我再試試，感謝>-<! 03/11 01:06