作者diffa2 (Zero)
看板Biotech
标题[求救] M15 competent cell protein induce
时间Tue Mar 8 14:00:10 2011
想请问是否有人使用过M15/[pREP4]来诱导protein的表现，目前在实验上遇到一些问题
想请教大家。
在clone上，设计一组primer带有BamHI cutting site 将基因的CDS (含有start codon
不含 stop codon)将其接入 pQE-60的BamHI site之後trnasformation到M15[pREP4]细菌
中表现。
plasmid的架构:
------------CC ATG GGA GGATCC ATG-------------------TAA----
vector上的 start codon BamHI CDS的start codon vector上的stop codon
transformation到M15/[pREP4] competent cell中涂盘到含有Kanamcyin(25μM) 及
Ampicillin(50μM)的LB plate，挑single colony到养菌管含有Kan(25μM) 和Amp(50μ
M)的3ml LB中，摇16小时候取500μl的菌液，以1:100的菌量放大加到含有Kan(25μM)和
Amp (50μM)的50ml的LB中，置37℃incubator 3 hr後用IPTG induce 3~4 hr (37℃)，最
後跑胶的结果都没有induce出来。之後分别用了不同浓度的IPTG indce (0.005mM~100mM)
也都没有induce出protein。
之後也将M15/[pREP4] competent cell分别划菌在含有Kan(25μM ) 和Amp(50μM)的
plate中，在amp的LB-plate菌没有长可是在Kan的LB-plate中有长，接着将Kan plate中的
single colony到含有Kan(25μM)的3ml LB中摇16小时抽菌的plasmid，pREP4 plasmid大
小3740 bp但我抽出来的plasmid supercoil form跑胶大小在9 Kb的位置，但在Kan plate
中会长colony但抽出的plasmid大小有不同，不知问题出在哪里。
想请问是否有人有用M15/[pREP4]诱导过protein，请教各位了><”。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.48.76
1F：推 kenseifan:你IPTG用量好像有点低 03/08 20:37
2F：→ diffa2:我试过的浓度由最低0.005mM到最高100mM，在Qiagen protocol 03/08 23:54
3F：→ diffa2:是使用1mM,我试过0.005mM,0.01mM,0.05mM,0.1mM,0.5mM,1mM 03/09 00:03
4F：→ diffa2:10mM,50mM,100mM,跑protein胶出现的pattern都相同 03/09 00:07
5F：推 kenseifan:我之前的一个经验是 M15长的非常快 所以INDUCTION的时间 03/09 09:56
6F：→ kenseifan:不能太长 要不然就是降低温度 03/09 09:56
7F：→ diffa2:想再请问一下，induce後的protein会和induce前会有明显的差 03/09 19:32
8F：→ diffa2:异吗?是否可辨别出诱导後的protein有明显的表现出来。 03/09 19:36
9F：→ diffa2:有试过室温induce(约20度)5小时，可能时间太久跑胶後没差异 03/09 19:40
10F：推 kenseifan:有阿 跑胶看的出来阿 你可以试试18度 03/10 09:51
11F：→ diffa2:嗯嗯~我再试试，感谢>-<! 03/11 01:06