作者dovuwa (微笑使人更美)
看板Biotech
標題[求救] SDS PAGE完全沒有band 除了marker
時間Sun Feb 27 16:38:58 2011
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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我最近在純化一蛋白質
transformation--> IPTG induction--> lysis cell(E.Coli)
將lysis後分離出sup 及 pellet
並拿來跑膠
但是最後我跑SDS-PAGE 出來
並用cromassie blue染膠
destain後 卻是空白的
除了marker以外
我做了2-3次了
我不懂 怎麼會連pellet都沒有任何protein
有人知道為什麼嗎?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.25.186
1F：推 chosenone:你講的空白是說看不到你要的東西還是整條都空白沒有任何 02/27 19:50
2F：→ chosenone:的東西? 02/27 19:50
3F：→ dovuwa:整條都沒有東西 連pellet 都沒有真的很奇怪~ 02/27 20:59
4F：→ dovuwa:我也有做positive control但是連positive control也是這樣 02/27 21:01
5F：→ turtle24:pellet量太少? 或是太多沒煮開? 或是reducing dye壞了? 02/28 00:16
6F：推 maq:SDS PAGE中SDS比例? protein sample treatment? 02/28 01:15
7F：→ sardine:送張圖上來比較好讓李組長了解案情唷... 02/28 10:35
8F：→ crazydog0229:Competent cell有無用錯? 02/28 14:47
9F：推 chosenone:因為marker有染到 所以最有可能是樣品處理的問題 02/28 18:17
10F：→ chosenone:樣品定量了沒 你加多少樣品下去跑? 02/28 18:19
11F：→ dovuwa:PO 圖喔 要怎麼PO? 03/01 15:50
12F：→ dovuwa:我沒有定量耶 因為我只是想看有沒有我想要的東西在裡面 03/01 15:51
13F：→ dovuwa:我養了15 ml的terrific broth~我都load 10ul跑膠 03/01 15:52
14F：→ dovuwa:dye應該沒問題 因為實驗室裡有另一個學弟也都用同一罐dye 03/01 15:53
15F：→ dovuwa:應該也沒問題才對 太多沒煮開會有很大影響嗎? 03/01 15:54
16F：→ dovuwa:competent cell我是用rosetta 03/01 15:58
17F：→ dovuwa:lysis cell後就加sample buffer(final 1X) boil92度C 20分 03/01 16:04
18F：→ dovuwa:然後mix well就load 膠啦 03/01 16:05
19F：推 chosenone:你有別的東西可以拿來確定電泳系統有沒有問題嗎? 03/01 23:42
20F：→ chosenone:像是之前成功跑的樣品 或是別人的樣品有成功過的 03/01 23:43
21F：→ chosenone:如果你們家有別人 建議他要跑時你借幾個well一起跑 03/01 23:45
22F：→ chosenone:不過會一片空白 我還是覺得樣品處理有問題 尤其是定量 03/01 23:46
23F：→ dovuwa:結果我又重新做一次 養細胞的方式 用terrific broth warm 03/06 17:28
24F：→ dovuwa:up 在進行induction 我用了原本的lysis cell的protocol和 03/06 17:29
25F：→ dovuwa:另一種最初的protocol denature也減短至10min 03/06 17:30
26F：→ dovuwa:load 20ulrun SDS PAGE發現這次跑出來就每個lane都有東西 03/06 17:32
27F：→ dovuwa:所以之前pellet會完全空白 是因為denature太過嚴重嗎 03/06 17:33