作者dovuwa (微笑使人更美)
看板Biotech
标题[求救] SDS PAGE完全没有band 除了marker
时间Sun Feb 27 16:38:58 2011
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
我最近在纯化一蛋白质
transformation--> IPTG induction--> lysis cell(E.Coli)
将lysis後分离出sup 及 pellet
并拿来跑胶
但是最後我跑SDS-PAGE 出来
并用cromassie blue染胶
destain後 却是空白的
除了marker以外
我做了2-3次了
我不懂 怎麽会连pellet都没有任何protein
有人知道为什麽吗?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.25.186
1F：推 chosenone:你讲的空白是说看不到你要的东西还是整条都空白没有任何 02/27 19:50
2F：→ chosenone:的东西? 02/27 19:50
3F：→ dovuwa:整条都没有东西 连pellet 都没有真的很奇怪~ 02/27 20:59
4F：→ dovuwa:我也有做positive control但是连positive control也是这样 02/27 21:01
5F：→ turtle24:pellet量太少? 或是太多没煮开? 或是reducing dye坏了? 02/28 00:16
6F：推 maq:SDS PAGE中SDS比例? protein sample treatment? 02/28 01:15
7F：→ sardine:送张图上来比较好让李组长了解案情唷... 02/28 10:35
8F：→ crazydog0229:Competent cell有无用错? 02/28 14:47
9F：推 chosenone:因为marker有染到 所以最有可能是样品处理的问题 02/28 18:17
10F：→ chosenone:样品定量了没 你加多少样品下去跑? 02/28 18:19
11F：→ dovuwa:PO 图喔 要怎麽PO? 03/01 15:50
12F：→ dovuwa:我没有定量耶 因为我只是想看有没有我想要的东西在里面 03/01 15:51
13F：→ dovuwa:我养了15 ml的terrific broth~我都load 10ul跑胶 03/01 15:52
14F：→ dovuwa:dye应该没问题 因为实验室里有另一个学弟也都用同一罐dye 03/01 15:53
15F：→ dovuwa:应该也没问题才对 太多没煮开会有很大影响吗? 03/01 15:54
16F：→ dovuwa:competent cell我是用rosetta 03/01 15:58
17F：→ dovuwa:lysis cell後就加sample buffer(final 1X) boil92度C 20分 03/01 16:04
18F：→ dovuwa:然後mix well就load 胶啦 03/01 16:05
19F：推 chosenone:你有别的东西可以拿来确定电泳系统有没有问题吗? 03/01 23:42
20F：→ chosenone:像是之前成功跑的样品 或是别人的样品有成功过的 03/01 23:43
21F：→ chosenone:如果你们家有别人 建议他要跑时你借几个well一起跑 03/01 23:45
22F：→ chosenone:不过会一片空白 我还是觉得样品处理有问题 尤其是定量 03/01 23:46
23F：→ dovuwa:结果我又重新做一次 养细胞的方式 用terrific broth warm 03/06 17:28
24F：→ dovuwa:up 在进行induction 我用了原本的lysis cell的protocol和 03/06 17:29
25F：→ dovuwa:另一种最初的protocol denature也减短至10min 03/06 17:30
26F：→ dovuwa:load 20ulrun SDS PAGE发现这次跑出来就每个lane都有东西 03/06 17:32
27F：→ dovuwa:所以之前pellet会完全空白 是因为denature太过严重吗 03/06 17:33