作者Marriott (有功夫無懦夫)
看板Biotech
標題[求救] protein purification
時間Sat Jan 22 21:06:42 2011
請問一下各位不知道是否有遇過這樣的情況呢?
在表現的時候
我的vector是pET15b,用E.coil BL21(DE3)
在500ml TB,OD600約1.0的環境下
用0.5mM ITPG, 1mM PMSF,10uM FeCl3和d-ALA在20度C下去induction 15hrs
基本上overexpression是沒有問題
破菌完的crude extra及pellet去跑膠
都可以看得出來protein絕大部分都在supernatant中
但是一進FPLC純化
(用的是5ml HiTrap Ni-NTA column,過程中壓力都約在0.05~0.1MPa)
除了在0%,2%,6%及10%wash (100% =500mM imidazole)的位置有280nm的吸收peak以外
就沒有明顯peak的出現了
(20-100%的gradient wash 吸光值都差不多)
(flow through有一點點,可能是column overloading,
0%,2%,6%及10%wash也有跑page,全都是雜protein)
試了數次也都是一樣的情況
目前我有想了數個情況
(1) his tag掉了?
但是try induction條件前才定序過,應該機率不高吧
(2) 500mM imidazole仍elute不下來?
his tag會bind的這麼緊嗎
(3) 這個protein不喜歡這個buffer吧?
我用的是25mM Tris-Cl, 500mM NaCl,10mM MgCl2, 1mM PMSF, 5mM 2-ME,pH7.4
基本上這個pH和2-ME 對Ni-column的work是沒有太大影響
打得落落長
不知道有人有相似的經驗能做個分享嗎
感謝
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◆ From: 59.126.12.177
※ 編輯: Marriott 來自: 59.126.12.177 (01/22 21:09)
1F：推 aggaci:6H被擋住...把6H換邊 01/22 22:29
2F：→ Marriott:我的his tag在一個大loop上,後面又有一段thrombin site 01/22 23:20
3F：→ Marriott:這樣仍會有被擋住的可能嗎? 01/22 23:21
4F：→ Marriott:但我的flow through裡有target protein,但相對來說滿少的 01/22 23:23
5F：推 mattmatt:跑一塊native PAGE和SDS PAGE 看western能不能測到his 01/23 04:30
6F：→ mattmatt:我的case 100mM imidazole就會洗下來 200mM以上洗光光 01/23 04:32
7F：→ mattmatt:buffer是用Tris-Cl和NaH2PO4 pH8 感覺buffer影響較小 01/23 04:33
8F：→ mattmatt:可能還要測一下Ni-NTA agarose binding後flow過去的extra 01/23 04:35