作者Marriott (有功夫无懦夫)
看板Biotech
标题[求救] protein purification
时间Sat Jan 22 21:06:42 2011
请问一下各位不知道是否有遇过这样的情况呢?
在表现的时候
我的vector是pET15b,用E.coil BL21(DE3)
在500ml TB,OD600约1.0的环境下
用0.5mM ITPG, 1mM PMSF,10uM FeCl3和d-ALA在20度C下去induction 15hrs
基本上overexpression是没有问题
破菌完的crude extra及pellet去跑胶
都可以看得出来protein绝大部分都在supernatant中
但是一进FPLC纯化
(用的是5ml HiTrap Ni-NTA column,过程中压力都约在0.05~0.1MPa)
除了在0%,2%,6%及10%wash (100% =500mM imidazole)的位置有280nm的吸收peak以外
就没有明显peak的出现了
(20-100%的gradient wash 吸光值都差不多)
(flow through有一点点,可能是column overloading,
0%,2%,6%及10%wash也有跑page,全都是杂protein)
试了数次也都是一样的情况
目前我有想了数个情况
(1) his tag掉了?
但是try induction条件前才定序过,应该机率不高吧
(2) 500mM imidazole仍elute不下来?
his tag会bind的这麽紧吗
(3) 这个protein不喜欢这个buffer吧?
我用的是25mM Tris-Cl, 500mM NaCl,10mM MgCl2, 1mM PMSF, 5mM 2-ME,pH7.4
基本上这个pH和2-ME 对Ni-column的work是没有太大影响
打得落落长
不知道有人有相似的经验能做个分享吗
感谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 59.126.12.177
※ 编辑: Marriott 来自: 59.126.12.177 (01/22 21:09)
1F：推 aggaci:6H被挡住...把6H换边 01/22 22:29
2F：→ Marriott:我的his tag在一个大loop上,後面又有一段thrombin site 01/22 23:20
3F：→ Marriott:这样仍会有被挡住的可能吗? 01/22 23:21
4F：→ Marriott:但我的flow through里有target protein,但相对来说满少的 01/22 23:23
5F：推 mattmatt:跑一块native PAGE和SDS PAGE 看western能不能测到his 01/23 04:30
6F：→ mattmatt:我的case 100mM imidazole就会洗下来 200mM以上洗光光 01/23 04:32
7F：→ mattmatt:buffer是用Tris-Cl和NaH2PO4 pH8 感觉buffer影响较小 01/23 04:33
8F：→ mattmatt:可能还要测一下Ni-NTA agarose binding後flow过去的extra 01/23 04:35