作者waitingu (Phil-Ku)
看板Biotech
標題Re: [求救] 菌長出來裡面什麼都沒有
時間Fri Jan 21 18:02:01 2011
※ 引述《FENOR (FENOR)》之銘言：
: 這一個月來每次做clone都遇到這樣的事情，
: 在ligation並且transform進去之後到菌落長出來這一個步驟都沒有問題，
: 可是每次用長出來的菌落來抽mini-prep，抽出來的產物digest後拿去跑膠，
: 每次跑都是空的，連vector都沒有，
: 這是怎麼一回事啊@@
: 我已經快被這樣的情況搞死了.....總覺得我不太適合這一行。
剛好前一陣子也碰到同樣的問題
也是跟原po類似，甚麼變因感覺都考慮過了
結果之後問題出在抗生素...
1.抗生素是用甚麼水去泡的
我那時候是用一次水，後來用D2水，再後來用D2滅菌水
2.抗生素泡完有過濾嗎(用小飛碟)
3.就算是新買的抗生素 強如Kan+，也有可能失效：藥品保存的問題
永遠不要覺得你有乖乖用別人也有乖乖用XD(建議去別家借一點來試試)
總之，最後成功的條件是，D2滅菌水+0.22小飛碟+兩倍劑量
終於成功的挑到
一點經驗分享提供給原PO參考^^
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.97
1F：推 iceking:推~ 不過你一開始居然用一次水,真猛! 01/21 18:46
2F：推 SureWinmouse:用一次水這點來說 你真的很屌... 01/21 21:07
3F：推 qumai:@@" 我是用滅菌過的二次水配 不過沒有再過濾 01/21 22:21
4F：推 oplz:好奇地問 為何一次水不行? 過濾的目的跟功用為何? 01/22 10:54
5F：→ Ianthegood:孩子 如果一次水就可以就不用有二次水這種東西了 01/22 12:32
6F：→ Ianthegood:有些東西滅一次死不了 飛碟是用很小的孔隙濾掉微生物 01/22 12:32
7F：推 oplz:所以為甚麼一次水不行? 01/22 13:19
8F：→ oplz:甚麼東西死不了? 01/22 13:21
9F：推 skyken10:重點應該在~抗生素是不是無菌的~然後能不能work~! 01/22 15:12
10F：→ skyken10:一次水或二次水在這種實驗裡面應該是沒多大的影響~! 01/22 15:19
11F：推 oplz:再問一下. 抗生素裡為何會有菌 能耐 stock 中的高濃度抗生素? 01/22 17:55
12F：推 mattmatt:視抗生素的作用和何種菌 還有titer 每一種菌(細菌/真菌) 01/22 18:43
13F：→ mattmatt:能耐受的抗生素種類不同 劑量也不同 01/22 18:43
14F：→ mattmatt:要是對菌沒作用的話 stock的濃度也殺不死 01/22 18:44
15F：→ mattmatt:所以才有所謂超級細菌 萬古黴素都殺不死的那種... 01/22 18:45
16F：推 liuse:我也覺得為啥用一次水不行啊？ 雖然我也都用二次水 01/22 22:28
17F：推 Ianthegood:沒有不行阿 自來水也行阿 01/22 23:07
18F：→ a001ou:雖然都用2次水但1次水應該也沒問題 感覺除了藥品存放外 其 01/23 09:07
19F：→ a001ou:他因素應該都非常微小 有做過微生物實驗的應該瞭解 操作未 01/23 09:08
20F：→ a001ou:必需要Hood 往往在實驗桌上開酒精燈操作了 所以污染並不是 01/23 09:08
21F：→ a001ou:這麼容易發生的 01/23 09:09
22F：推 bluecsky:還要考亮你用的菌株本身抗受性問題 有的菌株就是比較耐 01/23 10:06
23F：→ bluecsky:或者抗生素保存不當或品質不夠好 才會效率下降 01/23 10:07
24F：→ bluecsky:二次水一次水 有無過filter 我是覺得case by case 01/23 10:08
25F：→ bluecsky:最大問題還是在藥品當下的品質 還有你的菌株 01/23 10:09
26F：推 Realthugz:抗生素 plasmid本身 reagent 要抓出問題就是做control吧 01/23 19:56
27F：→ Realthugz:plasmid可能是hi copy lo copy 有的更詭異本來就不好抽 01/23 19:57
28F：→ Realthugz:就這樣跑上來問並沒有訓練到你獨立抓出問題的能力... 01/23 19:58
29F：推 FENOR:其實問題在我發問後過了幾個小時就找出來了...至少是找出 01/24 00:28
30F：→ FENOR:其中一個，當時是在考慮抗生素的問題。所以當時用了新泡 01/24 00:29
31F：→ FENOR:的kana去篩選之後就成功的挑出了有construct的clone 01/24 00:29