作者waitingu (Phil-Ku)
看板Biotech
标题Re: [求救] 菌长出来里面什麽都没有
时间Fri Jan 21 18:02:01 2011
※ 引述《FENOR (FENOR)》之铭言：
: 这一个月来每次做clone都遇到这样的事情，
: 在ligation并且transform进去之後到菌落长出来这一个步骤都没有问题，
: 可是每次用长出来的菌落来抽mini-prep，抽出来的产物digest後拿去跑胶，
: 每次跑都是空的，连vector都没有，
: 这是怎麽一回事啊@@
: 我已经快被这样的情况搞死了.....总觉得我不太适合这一行。
刚好前一阵子也碰到同样的问题
也是跟原po类似，甚麽变因感觉都考虑过了
结果之後问题出在抗生素...
1.抗生素是用甚麽水去泡的
我那时候是用一次水，後来用D2水，再後来用D2灭菌水
2.抗生素泡完有过滤吗(用小飞碟)
3.就算是新买的抗生素 强如Kan+，也有可能失效：药品保存的问题
永远不要觉得你有乖乖用别人也有乖乖用XD(建议去别家借一点来试试)
总之，最後成功的条件是，D2灭菌水+0.22小飞碟+两倍剂量
终於成功的挑到
一点经验分享提供给原PO参考^^
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.97
1F：推 iceking:推~ 不过你一开始居然用一次水,真猛! 01/21 18:46
2F：推 SureWinmouse:用一次水这点来说 你真的很屌... 01/21 21:07
3F：推 qumai:@@" 我是用灭菌过的二次水配 不过没有再过滤 01/21 22:21
4F：推 oplz:好奇地问 为何一次水不行? 过滤的目的跟功用为何? 01/22 10:54
5F：→ Ianthegood:孩子 如果一次水就可以就不用有二次水这种东西了 01/22 12:32
6F：→ Ianthegood:有些东西灭一次死不了 飞碟是用很小的孔隙滤掉微生物 01/22 12:32
7F：推 oplz:所以为甚麽一次水不行? 01/22 13:19
8F：→ oplz:甚麽东西死不了? 01/22 13:21
9F：推 skyken10:重点应该在~抗生素是不是无菌的~然後能不能work~! 01/22 15:12
10F：→ skyken10:一次水或二次水在这种实验里面应该是没多大的影响~! 01/22 15:19
11F：推 oplz:再问一下. 抗生素里为何会有菌 能耐 stock 中的高浓度抗生素? 01/22 17:55
12F：推 mattmatt:视抗生素的作用和何种菌 还有titer 每一种菌(细菌/真菌) 01/22 18:43
13F：→ mattmatt:能耐受的抗生素种类不同 剂量也不同 01/22 18:43
14F：→ mattmatt:要是对菌没作用的话 stock的浓度也杀不死 01/22 18:44
15F：→ mattmatt:所以才有所谓超级细菌 万古霉素都杀不死的那种... 01/22 18:45
16F：推 liuse:我也觉得为啥用一次水不行啊？ 虽然我也都用二次水 01/22 22:28
17F：推 Ianthegood:没有不行阿 自来水也行阿 01/22 23:07
18F：→ a001ou:虽然都用2次水但1次水应该也没问题 感觉除了药品存放外 其 01/23 09:07
19F：→ a001ou:他因素应该都非常微小 有做过微生物实验的应该了解 操作未 01/23 09:08
20F：→ a001ou:必需要Hood 往往在实验桌上开酒精灯操作了 所以污染并不是 01/23 09:08
21F：→ a001ou:这麽容易发生的 01/23 09:09
22F：推 bluecsky:还要考亮你用的菌株本身抗受性问题 有的菌株就是比较耐 01/23 10:06
23F：→ bluecsky:或者抗生素保存不当或品质不够好 才会效率下降 01/23 10:07
24F：→ bluecsky:二次水一次水 有无过filter 我是觉得case by case 01/23 10:08
25F：→ bluecsky:最大问题还是在药品当下的品质 还有你的菌株 01/23 10:09
26F：推 Realthugz:抗生素 plasmid本身 reagent 要抓出问题就是做control吧 01/23 19:56
27F：→ Realthugz:plasmid可能是hi copy lo copy 有的更诡异本来就不好抽 01/23 19:57
28F：→ Realthugz:就这样跑上来问并没有训练到你独立抓出问题的能力... 01/23 19:58
29F：推 FENOR:其实问题在我发问後过了几个小时就找出来了...至少是找出 01/24 00:28
30F：→ FENOR:其中一个，当时是在考虑抗生素的问题。所以当时用了新泡 01/24 00:29
31F：→ FENOR:的kana去筛选之後就成功的挑出了有construct的clone 01/24 00:29