作者FENOR (FENOR)
看板Biotech
標題[求救] 菌長出來裡面什麼都沒有
時間Thu Jan 20 16:51:26 2011
這一個月來每次做clone都遇到這樣的事情，
在ligation並且transform進去之後到菌落長出來這一個步驟都沒有問題，
可是每次用長出來的菌落來抽mini-prep，抽出來的產物digest後拿去跑膠，
每次跑都是空的，連vector都沒有，
這是怎麼一回事啊@@
我已經快被這樣的情況搞死了.....總覺得我不太適合這一行。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.135.214
1F：推 aeroufo:你菌是不是養過頭壓 01/20 17:02
2F：→ FENOR:應該不是，我只養了16-18小時(transform完) 01/20 17:06
3F：→ FENOR:挑菌養到MEDIUM裡面也只養了六七個小時就抽了 01/20 17:07
4F：推 owl628:挑菌養要不要也養個16小時左右??? 01/20 17:50
其實比較擔心的是抽出來是全空的，這次抽出來就是全空的@@
我現在正在讓菌長久一點，大概晚上九點還要再抽一次，
應該會跑一個不digest直接比較絕對大小的看看，
如果這樣還是空的那我大概得去檢查competent cells了。
(可是這一批其實去年十一月用都還好好的...)
※ 編輯: FENOR 來自: 140.112.135.214 (01/20 17:53)
5F：推 owl628:你不digest要怎麼比大小???還有competent cell去年11月好好 01/20 18:01
6F：→ owl628:的,不代表現在就是好好的,擔心的話就做個positive control 01/20 18:02
7F：→ FENOR:跟空的vector比@@ 其實我只是想先看看裡面有沒有東西而已 01/20 18:13
8F：→ FENOR:晚點我來transform一個只有vector的好了 01/20 18:14
9F：推 aeroufo:還有就是你的抗生素加的夠不夠壓，如果不夠菌也是會丟掉 01/20 18:15
10F：→ aeroufo:plasmid唷 01/20 18:16
11F：推 iceking:連vector的band都沒有嗎? 還是只有insert的沒有? 01/20 18:17
12F：→ iceking:去測一下DNA濃度吧,說不定抽太少了看不到 01/20 18:18
13F：推 iceking:理論上沒vector的菌不太可能會長,要不要檢查一下抗生素 01/20 18:23
14F：→ FENOR:是連vector的band都沒有......抗生素是新的 01/20 18:25
15F：→ FENOR:抗生素的濃度應該是剛好。 01/20 18:26
16F：→ FENOR:況且就算是雜菌，應該也要有genomic或者是一些小片段 01/20 18:27
17F：推 Ianthegood:手抽過嗎?有沒可能是miniprep的問題? 01/20 19:26
18F：→ sardine:我有個問題...看時間來養菌這不是個很準的方法 01/21 00:42
19F：→ sardine:你手邊沒有儀器可以測一下菌的濃度嗎 01/21 00:43
20F：→ sardine:另外我覺得抽不到只有一個可能..菌早就死了 在你抽之前 01/21 00:43
21F：→ sardine:就流光了 01/21 00:44
22F：→ FENOR:樓上提到的這點我沒考慮過@@ 剛好有儀器，晚點來試試看 01/21 00:56
23F：→ sardine:你用kit抽嗎 如果DNA流掉了 在你加各種buffer的時候 01/21 01:03
24F：→ sardine:應該會有幾步跟你之前抽成功的時候 加進去的反應不太一樣 01/21 01:03
25F：→ sardine:觀查一下 01/21 01:03
26F：→ sardine:也可能像iceking說的量太少 總之只要量不夠一定會有幾步 01/21 01:04
27F：→ sardine:一看就知道不太一樣~~~~ 前提是你常常抽 看習慣了.. 01/21 01:05
其實我現在已經看得出來了@@ PD1 PD2 PD3加下去的產生的變化會不一樣，
最晚等到離心離下來就可以知道裡面到底有沒有東西。
不過說真的，失敗的經驗累積成這樣還真的讓人哭笑不得.......
※ 編輯: FENOR 來自: 140.112.135.214 (01/21 11:59)
28F：推 icome:搖太久amp都被消耗光當然沒plasmid 01/22 14:11