作者duck00192 (鴨子)
看板Biotech
標題[求救] 打斷protein 雙硫鍵的方法
時間Wed Jan 19 02:48:54 2011
我所研究的protein總共有四對雙硫鍵
已知它和某種cell line有很強的interaction
用點突變和cell ELISA的方法找出的結合位的區域大多與帶正電或疏水性amino acid 有關
目前推測他的三級結構會形成一個groove而與細胞上的ligand結合
因此我想設計實驗把這個三級的結構打亂看是否會影響其與細胞的結合力
但若把整個蛋白用urea 或者 GuHCl整個denature怕之後protein會沉澱
所以想用比較溫和的方式加入還原劑打斷雙硫鍵就好
但又要考慮這個還原劑是否對細胞會有毒性
目前考慮的是先在蛋白中加入reduced glutathione然後再把buffer置換掉
再來做MTT看是否對cell有毒性 之後再做cell ELISA
目前想到能做的大概就是這樣 但總覺得不夠完善
想請各位前輩指點一下 是否還有其他的方法
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◆ From: 140.114.100.164
※ 編輯: duck00192 來自: 140.114.100.164 (01/19 02:51)
1F：推 bluecsky:如果你置換掉之後馬上做實驗應該是沒問題 但是放久了 01/19 05:31
2F：→ bluecsky:雙硫鍵好像還是有可能會黏回去 因為我以前有做過也要打斷 01/19 05:32
3F：→ bluecsky:雙硫鍵後再黏回的實驗 我用高濃度DTT處理過後換buffer 01/19 05:33
4F：→ bluecsky:換完後放一段時間還會又黏了回去 當然不是100%都黏好好 01/19 05:34
5F：→ bluecsky:所以我個人建議是何不用可接受程度的還原劑劑量加入操作? 01/19 05:35
6F：→ bluecsky:記得控制組的條件也補還原劑就好 01/19 05:36
7F：推 sparktrix:mercaptoethanol? 01/19 13:32
8F：→ duck00192:謝謝樓上們的回覆~因為考慮到毒性的問題所以對選擇的還 01/19 15:43
9F：→ duck00192:原劑還在考慮用哪一種以即用多少濃度 01/19 15:43
10F：→ duck00192:可否再請教b大當初用DTT的劑量是多少還有如何可以知道 01/19 15:45
11F：→ duck00192:雙硫鍵又接回來?是用打MASS去看嗎 01/19 15:46
12F：推 icome:為何不用點突變把cysteine變成serine? 01/19 20:59
13F：推 bluecsky:可是我單純是蛋白試驗歐 沒做過細胞 至於如何知道 是看 01/19 23:28
14F：→ bluecsky:活性(我的有雙硫鍵就會失去活性)跟蛋白電泳圖(不加2-me) 01/19 23:29