作者duck00192 (鸭子)
看板Biotech
标题[求救] 打断protein 双硫键的方法
时间Wed Jan 19 02:48:54 2011
我所研究的protein总共有四对双硫键
已知它和某种cell line有很强的interaction
用点突变和cell ELISA的方法找出的结合位的区域大多与带正电或疏水性amino acid 有关
目前推测他的三级结构会形成一个groove而与细胞上的ligand结合
因此我想设计实验把这个三级的结构打乱看是否会影响其与细胞的结合力
但若把整个蛋白用urea 或者 GuHCl整个denature怕之後protein会沉淀
所以想用比较温和的方式加入还原剂打断双硫键就好
但又要考虑这个还原剂是否对细胞会有毒性
目前考虑的是先在蛋白中加入reduced glutathione然後再把buffer置换掉
再来做MTT看是否对cell有毒性 之後再做cell ELISA
目前想到能做的大概就是这样 但总觉得不够完善
想请各位前辈指点一下 是否还有其他的方法
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◆ From: 140.114.100.164
※ 编辑: duck00192 来自: 140.114.100.164 (01/19 02:51)
1F：推 bluecsky:如果你置换掉之後马上做实验应该是没问题 但是放久了 01/19 05:31
2F：→ bluecsky:双硫键好像还是有可能会黏回去 因为我以前有做过也要打断 01/19 05:32
3F：→ bluecsky:双硫键後再黏回的实验 我用高浓度DTT处理过後换buffer 01/19 05:33
4F：→ bluecsky:换完後放一段时间还会又黏了回去 当然不是100%都黏好好 01/19 05:34
5F：→ bluecsky:所以我个人建议是何不用可接受程度的还原剂剂量加入操作? 01/19 05:35
6F：→ bluecsky:记得控制组的条件也补还原剂就好 01/19 05:36
7F：推 sparktrix:mercaptoethanol? 01/19 13:32
8F：→ duck00192:谢谢楼上们的回覆~因为考虑到毒性的问题所以对选择的还 01/19 15:43
9F：→ duck00192:原剂还在考虑用哪一种以即用多少浓度 01/19 15:43
10F：→ duck00192:可否再请教b大当初用DTT的剂量是多少还有如何可以知道 01/19 15:45
11F：→ duck00192:双硫键又接回来?是用打MASS去看吗 01/19 15:46
12F：推 icome:为何不用点突变把cysteine变成serine? 01/19 20:59
13F：推 bluecsky:可是我单纯是蛋白试验欧 没做过细胞 至於如何知道 是看 01/19 23:28
14F：→ bluecsky:活性(我的有双硫键就会失去活性)跟蛋白电泳图(不加2-me) 01/19 23:29