※ 引述《soceress (贏了世界又如何)》之銘言： : 我最近也在收membrane protein : 檢體是rat spinal cord : 是買Pierce 的mem-per reagent 那組kit : 做到最後一個步驟,離心完, : 也是分三層, 上層是hydrophilic phase中間是一個很不明顯的interphase : 下層是hydrophobic phase : (應該跟原po是一樣的分層?) : 我要的是最下層的部份 : 它看起來一副就是充滿detergent的樣子 : specilaist是跟我說她其他的user收完後直接拿來做western blot : 但我照做了,最後看起來也是跟原po的RhoA一樣 : 看說明書上是可以用pierce的某kit透析掉detergent : 可是這樣又要買東西了 ^^|| : 除了想問跟原po一樣的問題(去除detergent) : 還想問問有哪位也用過這組收膜蛋白的kit,之後做western的?? : 做出來也會這樣嗎? : 要如何解決這樣的問題?? : 或是在配running用的檢體時,用PBS或TBS去調整濃度,讓detergent稍微稀釋掉一些?? : 謝謝大家~ : ※ 引述《waitingu (Phil-Ku)》之銘言： : : 最近的實驗必須要看 : : non-receptor tyrosine kinase在不同條件下被recruit到membrane的情形 : : 閱讀了一些期刊後發現，普遍的做法是用Triton X-100 + sucrose gradient分層 : : 此作法通常需要超高速離心 : : 但好像也有一種做法是用Triton X-114去做分層，但不需要超高速離心 : : (由於老師一直恐嚇說如果超高速離心沒處理好，會提早畢業但沒證書，因此能儘量不用 : : 就不用那台老機器)，因此... : : 1. 想請問一下，這兩種做法的差異性在哪？ : : 2. 如果是Triton X-114這種做法，所看到的分層現象，應該是 : : (上層) 水層 (中間)Sucrose cashion (下層)detergent phase : : 還是順序有所差別呢？ : : 3. 我試了幾次 Triton X-114作法 : : 發現可以抽出membrane-associated protein (例如Rho) : : 但SDS-PAGE跑出來的band卻會smear(如圖 : : http://img545.imageshack.us/f/25531824.jpg/右邊那條) : : 推測可能是detergent含量太多，但如果用Acetone沉澱後，蛋白會無法回溶 : : 請問版友們對去除detergent步驟是否有好的建議？ 經過幾次的嘗試以及改進 我想我可以解答自己與版友的幾個問題@@" 1. Sucrose gradient分離的是細胞膜(自己做是在Top to down約#2~#5的地方) (需搭配caveolin或是flotilin作為lipid raft marker) 而只要protein是在membrane上或附近(有associated)都可以detect到 其他胞器包括polisome, ER, 核膜等都會在其他的fraction處(比重不同) 而Triton X-114的方法則是分離親水性及忌水性蛋白 所以通常是拿來分離integral protein(有忌水性domain) 但不保證可以拿來分離所有與membrane上或相關的蛋白 PS :最近的幾次實驗用DSP去cross-linking後，發現連non-receptor tyrosine kinase 或是一些RTK都可以分離得出來，但文獻很少這樣做 因此我想，研究RTK或是一些membrane-associated protein還是以sucorse分離為佳 2. 分層應該是 水層在最上，sucrose cashion中間，detergent層在最下 (用長一點的tube，對著光看管子會比較明顯) 3. 這次我用methanol-chloroform方式沉澱蛋白 再以RIPA+6M Urea,2M thio-urea,DTT Soln.回溶，果然大部分的都溶掉了 而一些phospho-form的protein也還detect的出來 因此可以考慮用這種方法純化 (應該是不用到透析或過column啦) 一點點小心得，歡迎各位版友再來討論^^ --

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