※ 引述《soceress (赢了世界又如何)》之铭言： : 我最近也在收membrane protein : 检体是rat spinal cord : 是买Pierce 的mem-per reagent 那组kit : 做到最後一个步骤,离心完, : 也是分三层, 上层是hydrophilic phase中间是一个很不明显的interphase : 下层是hydrophobic phase : (应该跟原po是一样的分层?) : 我要的是最下层的部份 : 它看起来一副就是充满detergent的样子 : specilaist是跟我说她其他的user收完後直接拿来做western blot : 但我照做了,最後看起来也是跟原po的RhoA一样 : 看说明书上是可以用pierce的某kit透析掉detergent : 可是这样又要买东西了 ^^|| : 除了想问跟原po一样的问题(去除detergent) : 还想问问有哪位也用过这组收膜蛋白的kit,之後做western的?? : 做出来也会这样吗? : 要如何解决这样的问题?? : 或是在配running用的检体时,用PBS或TBS去调整浓度,让detergent稍微稀释掉一些?? : 谢谢大家~ : ※ 引述《waitingu (Phil-Ku)》之铭言： : : 最近的实验必须要看 : : non-receptor tyrosine kinase在不同条件下被recruit到membrane的情形 : : 阅读了一些期刊後发现，普遍的做法是用Triton X-100 + sucrose gradient分层 : : 此作法通常需要超高速离心 : : 但好像也有一种做法是用Triton X-114去做分层，但不需要超高速离心 : : (由於老师一直恐吓说如果超高速离心没处理好，会提早毕业但没证书，因此能尽量不用 : : 就不用那台老机器)，因此... : : 1. 想请问一下，这两种做法的差异性在哪？ : : 2. 如果是Triton X-114这种做法，所看到的分层现象，应该是 : : (上层) 水层 (中间)Sucrose cashion (下层)detergent phase : : 还是顺序有所差别呢？ : : 3. 我试了几次 Triton X-114作法 : : 发现可以抽出membrane-associated protein (例如Rho) : : 但SDS-PAGE跑出来的band却会smear(如图 : : http://img545.imageshack.us/f/25531824.jpg/右边那条) : : 推测可能是detergent含量太多，但如果用Acetone沉淀後，蛋白会无法回溶 : : 请问版友们对去除detergent步骤是否有好的建议？ 经过几次的尝试以及改进 我想我可以解答自己与版友的几个问题@@" 1. Sucrose gradient分离的是细胞膜(自己做是在Top to down约#2~#5的地方) (需搭配caveolin或是flotilin作为lipid raft marker) 而只要protein是在membrane上或附近(有associated)都可以detect到 其他胞器包括polisome, ER, 核膜等都会在其他的fraction处(比重不同) 而Triton X-114的方法则是分离亲水性及忌水性蛋白 所以通常是拿来分离integral protein(有忌水性domain) 但不保证可以拿来分离所有与membrane上或相关的蛋白 PS :最近的几次实验用DSP去cross-linking後，发现连non-receptor tyrosine kinase 或是一些RTK都可以分离得出来，但文献很少这样做 因此我想，研究RTK或是一些membrane-associated protein还是以sucorse分离为佳 2. 分层应该是 水层在最上，sucrose cashion中间，detergent层在最下 (用长一点的tube，对着光看管子会比较明显) 3. 这次我用methanol-chloroform方式沉淀蛋白 再以RIPA+6M Urea,2M thio-urea,DTT Soln.回溶，果然大部分的都溶掉了 而一些phospho-form的protein也还detect的出来 因此可以考虑用这种方法纯化 (应该是不用到透析或过column啦) 一点点小心得，欢迎各位版友再来讨论^^ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 61.62.75.94