作者myrhino (BUBU小胖子)
看板Biotech
標題[求救] real time PCR standard curve之建立
時間Thu Jan 13 10:28:46 2011
目前使用的機器型號是eppendorf Mastercycle reaplex 4
想要利用Taqman偵測血球細胞裡面的mRNA表現
本來想要轉成cDNA以後上機 但發現有時候結果會出不來
實驗步驟如下
抽取血液後用ficoll分層 取PBMC 養在flack overnight
取未貼與貼附細胞 用trizol抽RNA 測定OD值
取1 ug RNA 以DNase處理 （最後加上buffer量 總體積會變成10ul）
然後有試過用Oligo dT 轉成cDNA但上機以後會有跑不出來的情況
之後改用與上機用一樣的 primer轉 結果會比較ok 但還是有一些Ct值會出不來
(跑45 cycle 加入的cDNA為5 總反應總體積是20 ul )
有試過用直接用DNase處理過的 RNA sample直接上機 Ct值表現結果較好
(跑45cycle 加入RNA 4ul 總反應體積是20 ul)
所以之後想要直接用RNA上機
可是不知道用 RNA做出來的Ct值 可不可以同樣用 plasmid所建立的standard curve
來計算他的copy數
另外想請問 是否有必要再加一個house keeping gen 一起來上機跑real time
將最後的結果變成 目標mRNA Ct值/ house keeping Ct值
（但這樣好像就變成相對定量？）
因為是新手做 所以很多問題
感謝大家耐心看完 希望能給我一些意見
感謝大家！！
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.96.135
1F：推 mattmatt:RT反應完後cDNA有稀釋過嗎? 有些RT buffer會抑制PCR反應 01/13 16:55
2F：→ mattmatt:另外DNase處理完的RNA直接上機可以跑?!?!?! 01/13 16:55
3F：→ mattmatt:要嘛就是DNA殘留...要嘛就是你們家酵素相當厲害... 01/13 16:56
4F：→ mattmatt:最後..不知你們的設計為何需要絕對定量..一般看基因表現 01/13 16:58
5F：→ mattmatt:大多使用house keeping gene去做相對定量.. 01/13 16:58
6F：→ mattmatt:印象中mRNA要做絕對定量來計算轉錄量還滿不容易的... 01/13 17:00