作者myrhino (BUBU小胖子)
看板Biotech
标题[求救] real time PCR standard curve之建立
时间Thu Jan 13 10:28:46 2011
目前使用的机器型号是eppendorf Mastercycle reaplex 4
想要利用Taqman侦测血球细胞里面的mRNA表现
本来想要转成cDNA以後上机 但发现有时候结果会出不来
实验步骤如下
抽取血液後用ficoll分层 取PBMC 养在flack overnight
取未贴与贴附细胞 用trizol抽RNA 测定OD值
取1 ug RNA 以DNase处理 （最後加上buffer量 总体积会变成10ul）
然後有试过用Oligo dT 转成cDNA但上机以後会有跑不出来的情况
之後改用与上机用一样的 primer转 结果会比较ok 但还是有一些Ct值会出不来
(跑45 cycle 加入的cDNA为5 总反应总体积是20 ul )
有试过用直接用DNase处理过的 RNA sample直接上机 Ct值表现结果较好
(跑45cycle 加入RNA 4ul 总反应体积是20 ul)
所以之後想要直接用RNA上机
可是不知道用 RNA做出来的Ct值 可不可以同样用 plasmid所建立的standard curve
来计算他的copy数
另外想请问 是否有必要再加一个house keeping gen 一起来上机跑real time
将最後的结果变成 目标mRNA Ct值/ house keeping Ct值
（但这样好像就变成相对定量？）
因为是新手做 所以很多问题
感谢大家耐心看完 希望能给我一些意见
感谢大家！！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.96.135
1F：推 mattmatt:RT反应完後cDNA有稀释过吗? 有些RT buffer会抑制PCR反应 01/13 16:55
2F：→ mattmatt:另外DNase处理完的RNA直接上机可以跑?!?!?! 01/13 16:55
3F：→ mattmatt:要嘛就是DNA残留...要嘛就是你们家酵素相当厉害... 01/13 16:56
4F：→ mattmatt:最後..不知你们的设计为何需要绝对定量..一般看基因表现 01/13 16:58
5F：→ mattmatt:大多使用house keeping gene去做相对定量.. 01/13 16:58
6F：→ mattmatt:印象中mRNA要做绝对定量来计算转录量还满不容易的... 01/13 17:00